目的:短链酰基辅酶A脱氢酶(SCAD)是酰基辅酶A脱氢酶家族的一员,特异性分解短链酰基辅酶A底物,是催化线粒体脂肪酸β氧化过程中的第一个限速酶。SCAD与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)有着密不可分的关系,SCAD是一种黄素蛋白,由4个亚基组成,每个亚基都包含一个分子的辅因子FAD。本文采用SCAD重组腺病毒和SCAD基因敲除小鼠,探讨SCAD表达水平与高血压血管重构之间的关系,并且运用临床现有药物FAD治疗高血压血管重构和内皮细胞凋亡,观察FAD激活SCAD表达水平,探讨FAD改善高血压血管重构及维持内皮细胞稳态的作用。方法:1.建立20月龄自然老龄化自发性高血压大鼠所致的慢性高血压血管重构模型。通过HE染色观察主动脉形态学变化;运用Western Blot和实时荧光定量PCR检测SCAD表达水平的变化,检测主动脉SCAD酶活性、FFA、ATP、NO含量;运用Western Blot检测p-eNOS(ser1177)、eNOS、Bcl2、Bax、Cleaved caspase3、NOX-2、NOX-4的表达,分析慢性高血压血管重构模型中脂肪酸氧化代谢、主动脉凋亡情况,研究SCAD与慢性高血压血管重构的关系。2.采用SCAD重组腺病毒治疗高血压血管重构模型。正常大鼠尾静脉注射不同剂量(生理盐水组,低剂量组:5×108 VP/mL/d;中剂量组5×10~100 VP/mL/d);高剂量组5×10~122 VP/mL/d)的SCAD重组腺病毒,确定最佳给药剂量,使SCAD在大鼠主动脉中达到最佳表达水平。采用12周龄自发性高血压大鼠,尾静脉给予8周SCAD重组腺病毒。通过血压测定,超声心动图检测评价大鼠心血管功能;采用HE染色、DHE染色、EVG染色、天狼星红染色、TUNEL染色,对主动脉重构情况进行多方位分析。采用SCAD荧光单标,检测大鼠主动脉SCAD的含量;采用Western Blot和实时荧光定量PCR检测主动脉SCAD蛋白及基因的表达变化,检测SCAD的酶活性变化,观察血清及主动脉游离脂肪酸含量变化、主动脉NO和ATP含量变化。运用Western Blot检测p-eNOS(ser1177)、eNOS、Bcl2、Bax、Cleaved caspase3、NOX-2、NOX-4的表达,分析探讨SCAD重组腺病毒对大鼠心功能及主动脉血管重构的影响。3.采用SCAD基因敲除小鼠模型,通过鼠尾鉴定SCAD-/-纯合子型敲除小鼠。运用Western Blot和实时荧光定量PCR检测小鼠主动脉SCAD蛋白及基因的表达变化。通过血压测定、超声心动图检测、心重比、评价SCAD-/-小鼠心血管功能;采用HE染色、DHE染色、EVG染色、天狼星红染色、TUNEL染色,对小鼠主动脉情况进行多方位分析。4.采用自发性高血压大鼠血管重构模型,尾静脉给予8周FAD治疗,探讨FAD辅助治疗高血压血管重构的作用。通过血压检测,评价FAD的降压作用。采用SCAD荧光单标,检测大鼠主动脉SCAD的含量;采用Western Blot和实时荧光定量PCR检测大鼠主动脉SCAD的表达变化,检测SCAD酶活性,分析FAD对大鼠主动脉SCAD表达的影响。采用HE染色、DHE染色、EVG染色、天狼星红染色,对大鼠主动脉情况进行多方位分析。检测血清和主动脉FFA含量、主动脉NO和ATP含量。运用Western Blot检测p-eNOS(ser1177)、eNOS、Caveolin-1、PGC-1α的表达,分析探讨FAD激活SCAD后,对大鼠血压和主动脉血管重构的影响及其可能的作用机制。5.采用叔丁基过氧化氢(tBHP)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立内皮细胞凋亡模型。采用Western Blot和实时荧光定量PCR检测FAD对人脐静脉内皮细胞SCAD表达的影响。采用DHE染色检测ROS含量。采用流式细胞术检测HUVECs凋亡现象。检测SCAD酶活性、FFA、ATP和NO含量。运用Western Blot检测p-eNOS(ser1177)、eNOS、Caveolin-1、PGC-1α的表达,分析评价FAD激活SCAD表达后,对内皮细胞稳态的影响及其可能的作用机制。结果:1.从自然老龄化慢性自发性高血压大鼠血管重构模型中发现,与4月龄大鼠相比,20月龄正常Wistar和SHR的血压均出现升高。与老龄Wistar组相比,老龄SHR组主动脉中SCAD的含量明显降低,脂肪酸氧化代谢下降,主动脉FFA含量明显增多,主动脉ATP和NO含量明显下降。与老龄Wistar组相比,老龄SHR组主动脉重构明显,血管壁增厚,血管中层纤维排列紊乱。与老龄Wistar组相比,老龄SHR组主动脉中的促进凋亡蛋白Cleaved caspase3、Bax表达显著上调,抑制凋亡蛋白Bcl2表达明显下调;与此同时,与老龄Wistar组相比,氧化应激相关蛋白NOX-2,在老龄SHR组中表达明显增高;老龄SHR组的eNOS磷酸化程度明显低于老龄Wistar组。2.Western blot结果显示,Ad-SCAD在低剂量(5×10~8VP/mL/d)时可显著上调SCAD的表达,因此,我们在随后的实验中,Ad-SCAD的最佳给药剂量确定为5×108 VP/mL/d。经Ad-SCAD治疗的大鼠主动脉中SCAD蛋白出现过表达,mRNA水平增高,SCAD酶活性增加;与Wistar+NS组相比,SHR+NS组大鼠的主动脉重构明显。与SHR+NS组相比,SHR+Ad-SCAD组的主动脉中SCAD表达增加,血压显著降低,心功能和血管重构明显改善,血管壁胶原沉积明显减少,血管ROS生成减少,血管壁细胞凋亡现象明显减轻,血清、主动脉游离脂肪酸含量明显减少,主动脉ATP和NO含量明显增加,eNOS磷酸化被激活。3.与野生型小鼠相比,SCAD基因敲除小鼠的心功能明显下降,EF值、FS值明显降低,收缩压、舒张压明显升高。采用Western Blot和实时荧光定量PCR检测主动脉SCAD蛋白和mRNA水平,确认小鼠血管壁的SCAD表达明显被敲低。从形态学结果发现,与野生型小鼠相比,SCAD敲除小鼠的血管壁发生明显变化,血管腔明显缩小,血管壁厚度/管腔比值明显增加,血管外膜层胶原增加,血管壁活性氧含量和细胞凋亡明显增加。4.从Western blot、实时荧光定量PCR和SCAD免疫荧光单标检测结果发现,FAD能够激活SHR大鼠主动脉SCAD的表达。与SHR+NS组相比,SHR+FAD组的血压明显下降,主动脉血管壁厚度明显降低,血管平滑肌排列明显改善,主动脉血管弹性纤维含量增加,主动脉胶原蛋白含量明显减少,主动脉弹性得到了明显恢复。SHR+FAD组主动脉中Caveolin-1蛋白表达显著下调,PGC-1α蛋白表达显著增加,主动脉FFA和ROS含量降低,ATP和NO含量明显增加,eNOS磷酸化被激活。5.在tBHP诱导的HUVECs凋亡模型中,FAD预处理后的HUVECs能够抵抗t BHP所诱导的细胞凋亡现象。与t BHP组相比,tBHP+FAD组中主动脉SCAD的表达和酶活性明显增加。tBHP+FAD组中FFA和ROS含量明显降低,细胞凋亡现象明显减轻,ATP和NO含量明显增加,eNOS磷酸化被激活。结论:SCAD参与改善高血压血管重构,与高血压血管重构呈负性调节作用。SCAD作为脂肪酸氧化代谢的关键酶,能够显著抑制内皮细胞凋亡,抑制高血压血管重构进程,可能与SCAD增加脂肪酸氧化代谢,影响游离脂肪酸内皮转运,减少线粒体ROS产生,纠正心血管能量失衡有关。SCAD有望成为辅助治疗高血压及高血压血管重构新靶点的可能性。