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在畜禽饲料中过量添加抗生素,会导致动物源食品存在严重的食用安全性隐患,饲料无抗化是大势所趋。豆粕作为油脂工业副产物,来源广泛、价格低廉、富含蛋白质,适合用于多肽生物饲料的制备,因此豆粕发酵技术有广阔的开发前景。然而,当前工业化发酵豆粕方法比较传统,存在发酵成本高、效率低、智能化水平差等问题。为此,本文以多肽含量为主要指标,研究嗜热菌高温固态发酵技术,旨在省去豆粕熟化灭菌环节,简化发酵流程,降低生产成本;研究发酵过程的低强度交变磁场强化技术及其机理,旨在提高发酵效率;研究发酵过程的近红外实时监测技术,旨在构建智能化控制系统,实现发酵过程的精准控制。具体的研究工作和主要结论如下:(1)以生物量、蛋白酶和pH值为评价指标,开展嗜热脂肪地芽孢杆菌液体发酵制种试验。将经筛选的胰蛋白胨大豆培养基定为发酵种子液培养基,经正交优化获得该菌最佳培养条件为:培养温度55℃、接种量3%、初始pH 7.0和摇床转速180 r/min。在此条件下,细菌菌落总数达到了7.49×108 CFU/mL。生长动力学研究结果表明,Gompertz模型对嗜热脂肪地芽孢杆菌生长过程拟合程度更高,相关系数R2达到0.9894。(2)以发酵豆粕多肽含量为指标进行高温发酵试验,获得的最佳发酵条件为:发酵时间50.04 h、发酵温度55.33℃、水料比1.34:1和接种量12.46%(v/v)。与原料相比,发酵豆粕多肽、粗蛋白、可溶性蛋白和总酚含量分别显著升高了148.58%、5.26%、37.47%和42.96%,胰蛋白酶抑制剂、粗纤维、粗脂肪和pH值分别降低了77.43%、14.63%、19.42%和22.90%,豆粕营养价值显著提高。研究结果表明,分子量>20 kDa的大分子蛋白β-伴大豆球蛋白α’,α和β亚基(90.5、71.5和55.2 kDa)、大豆球蛋白的酸性和碱性亚基(37.6和19.8 kDa)、Gly m Bd30k(30 kDa)以及Kunitz胰蛋白酶抑制剂(24 kDa)等食物性过敏原发生降解,小肽(200500 Da)和氨基酸(<200 Da)含量显著提高。回转式发酵罐(8 m3)放大验证试验结果显示,不灭菌高温发酵可以在保证一定发酵效果的同时,可省去蒸汽灭菌和粉碎步骤,降低生产成本。(3)以嗜热脂肪地芽孢杆菌生物量和发酵豆粕多肽含量为指标,进行低强度交变磁场强化种子液发酵和豆粕固态发酵试验。优化获得磁场强化种子液发酵最佳条件为:总发酵时间24 h、磁场在接种后第6 h介入、磁强度80 Gs、磁处理时长2 h。种子液菌落总数比无磁场组提高36.94%。优化获得磁场强化豆粕固态发酵最佳条件为:总发酵时间48 h、磁场在发酵后第14 h介入、磁强度80 Gs、磁处理时长5 h。发酵豆粕多肽含量相比于未加磁场组提高了12.32%,达70.86g/kg。透射电镜观察发现,经磁场强化后的菌体外观正常,核糖体数量升高,细胞膜增厚,增大了分泌蛋白合成与胞外转运能力,这可能是发酵后豆粕多肽含量进一步提高的原因之一。(4)嗜热脂肪地芽孢杆菌转录组学研究结果显示,磁场处理前后共有408条差异基因(156条表达量上调和252条表达量下调基因)。GO和KEGG富集分析发现,磁场处理后涉及核糖体(关键基因rplE/F/N/O/P/Q/R/V/X、rpsC/E/H/K/M和rpmD)、RNA聚合酶(关键基因rpoA/B/C)和氨基酸(关键基因hisA/B/D/F/H/I/Z、argB/D/F、carA/B、gltD、rocA、murD和ilvC)代谢合成相关基因的上调,使得微生物细胞氮循环处于一个比较活跃的过程中,胞外蛋白质和酶的分泌水平提高,有利于对发酵过程中底物蛋白的分解、提高多肽含量。磁场处理后,与DNA合成直接相关的holB(DNA聚合酶IIIδ亚基)基因发生下调,细胞复制速率大幅增加的可能性降低,磁处理后细菌相比于对照组只增殖36%左右可能与此有关。(5)嗜热脂肪地芽孢杆菌蛋白组学研究结果显示,磁场处理前后共有25个差异表达蛋白(12个上调和13个下调蛋白),细胞S-layer蛋白上调趋势增大了细胞粘附性和菌落形成能力,使得菌体更易与基质发生锚定。核糖体休眠能力的降低,加大了蛋白质和氨肽酶的合成速率。综合分析蛋白和转录组结果显示,磁处理后胞内涉及丙酮酸脱氢酶和磷酸丙糖异构酶表达的pdhA/B和tpiA基因上调,提高了糖代谢供能效率;核糖体涉及细胞延伸因子EF-Tu的rplV、rpsC和rplP基因上调,加速了氨基酰-tRNA向核糖体相应位点的转运,提高了肽链延伸效率。细胞在发酵过程中发生分泌和自溶作用时,可释放胞内积累的蛋白质(酶),增强发酵底物蛋白水解能力,提高多肽含量。(6)利用探头式近红外光谱仪,从发酵料层中取样后实时监测豆粕中多肽、粗蛋白和胰蛋白酶抑制剂含量的动态变化。多肽、粗蛋白和胰蛋白酶抑制剂指标最优联合子区间分别为5,6046,001、6,8077,205、8,0108,408和9,61510,000cm-1以及4,0004,663、4,6675,330、6,0016,665和6,6697,332 cm-1。Si-PLS定量建模结果显示,多肽含量的校正和预测模型Rc和Rp以及RMSECV和RMSEP分别为0.9494和0.9570以及4.45和4.06;粗蛋白含量校正和预测模型Rc和Rp以及RMSECV和RMSEP分别为0.9385和0.9346以及3.45和3.56;胰蛋白酶抑制剂含量校正和预测模型Rc和Rp以及RMSECV和RMSEP分别为0.9446和0.9492以及1.13和1.09。近红外光谱实时监测系统结合Si-PLS算法可快速监测到发酵豆粕中多肽、粗蛋白和胰蛋白酶抑制剂含量的变化,为高温固态发酵豆粕智能化生产系统设计奠定基础。(7)以基础日粮和添加抗生素日粮为对照组,进行添加50、100和150 g/kg高温固态发酵豆粕(HFSBM日粮组)饲料肉鸡喂养试验(42 d)。相比于两组对照组,HFSBM日粮组对肉鸡生长性能未有负面影响;胸腺(p=0.111和0.156)和法氏囊(p=0.274和0.051)重量有上升趋势,分别从0.08 g/100 g提高至0.110.12 g/100 g体重以及从0.090.10 g/100 g提高至0.100.12 g/100 g;血清谷草转氨酶(GOT)含量(p=0.112和p=0.024)下降,分别由478和598 U/L降低至334429 U/L;十二指肠吸收能力(绒毛高度VH,绒毛高度/隐窝深度V/C)显著(p=0.02&0.001和p=0.052&0.027)增加,VH分别由1358和1430μm增长至15081512μm;V/C分别由7.69和7.99提高至9.0310.54;空肠中枯草芽孢杆菌数量显著增加,由4.35和4.24 log CFU/mL显著(p<0.05)增加至5.616.63 log CFU/mL。肉鸡日粮中通过添加HFSBM替代原有豆粕不仅可以降低畜禽抗生素用量,还在增强肉鸡免疫系统、保护肝细胞、促进小肠吸收和改善肠道微生物方面有积极的作用。