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羊痘（Capripox，CP）是由绵羊痘病毒（Sheeppoxvirus，SPPV）和山羊痘病毒（Goatpoxvirus，GTPV）引起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病。病畜以体温升高，全身性丘疹或结节、水疱、内脏病变、乃至死亡为特征。口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and moth disease virus，FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫和羊痘都是危害性非常严重的疾病，均被世界动物卫生组织（OIE）列为A类重大传染病。本研究利用已经在我国广泛使用的山羊痘弱毒疫苗株（AV41），利用病毒在细胞内的同源重组，构建表达Asial型口蹄疫P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株。同时，为了构建表达多个外源基因的重组山羊痘弱毒株，还采用随机克隆的方法，筛选出该毒株（AV41）的一个复制非必需区。（1）选择胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因区域作为外源基因插入位点构建重组病毒。提取GTPVAV41株基因组DNA，设计特异性引物扩增TK基因及其两侧翼片段，获得了长度为2078bp的TK基因及两侧的同源臂。其中TK基因的ORF为534bp，编码178个氨基酸。核苷酸和氨基酸同源性分析表明，GTPVAV41株TK基因与参考毒株的核苷酸和氨基酸的同源性在95.5％-100.0％之间，说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。（2）为了使重组病毒能高效表达外源基因，构建一个真核生物基因表达盒P7.5-EGFP-P，通过痘苗病毒P7.5启动子来启动绿色荧光蛋白和FMDV Asial/YNBS-58株衣壳蛋白前体P1-2A3C的表达。以山羊痘病毒TK基因序列中的kpnⅠ酶切位点为插入点，将整体表达盒插入山羊痘病毒转移载体骨架pUC119-TK之中，构建了共表达FMDVP1-2A3C基因和绿色荧光蛋白基因的重组山羊痘病毒转移载体pTK-P7.5-EGFP-P。（3）病毒转移载体pTK-P7.5-EGFP-P转染GTPV AV41株感染的BHK-21细胞，转染后24h就可见到特异性荧光。经绿色荧光筛选重组病毒，RT-PCR检测FMDV P1-2A、3C基因，抗原捕获ELISA检测FMDV抗原，结果表明，成功获得了能稳定、正确表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK-/EGFP+/FMDV P1-2A3C+/GTPV。毒价测定结果表明，重组毒在BHK-21细胞上的毒价为105.5TCID50/0.1mL。（4）提取GTPVAV41株病毒基因组用HindⅢ酶切，酶切片段克隆到pUC18质粒中，得到6个不同大小的HindⅢ片段Puc18-A、Puc18-B、Puc18-C、Puc18-D、Puc18-E和Puc18-F，分别插入P7.5-P7.5-LacZ报告基因构建了PUA1，PUB1，PUC1，PUD1，PUE1，PUF1等6个重组转移载体质粒，转移载体转染GTPVAV41株感染的BHK-21细胞。在X-gal存在条件下通过蓝白斑筛选，获得了一株稳定表达LacZ基因的山羊痘病毒重组弱毒株，筛选出了GTPV AV41株的1个复制非必需基因片段。本研究首次在国内外尝试用山羊痘弱毒疫苗毒株为活载体表达FMDV基因，为反刍动物烈性传染病的防治开创了新的思路。羊痘病毒活载体的构建，将为反刍动物疾病基因工程活载体疫苗的研究奠定基础。