病毒性脑炎(简称病脑)是儿童常见的中枢神经系统感染性疾病。现已知多数病毒几乎均可引起病脑。全世界报道的病毒性脑炎正呈现新的流行趋势。近年由于疫苗的改进与普遍接种及传染媒介控制措施得力，具有季节性、流行性的乙脑、森林脑炎及各种小儿传染病发病率急剧下降，因而肠道病毒、疱疹病毒、呼吸道病毒等已成为小儿病毒性脑炎的常见病原。而近年发生或再现的病毒有：牛海绵样脑病(疯牛病)病原(朊病毒)，禽流感H5N1型，尼帕病毒，西尼罗病毒，传染性非典型肺炎病毒(SARS)，人类疱疹病毒6型(HHV6)，肠道病毒71型(EV71)等。 2003年、2004年夏季七月至秋季，在我国全国各地广泛流行“轻型脑炎”，患者多为儿童，7～8月份为发病高峰，8月中旬以后就诊人数骤减乃至消失。主要症状为：发热(38-41)℃，有颅内高压症状如喷射性呕吐等，无抽风，所有患者无死亡，无明显后遗症。与乙脑、散发性脑炎等以往常见中枢神经系统病毒感染有显著不同。辅助检查：血常规白细胞计数正常；脑脊液常规：外观清晰透明，有核细胞计数正常或略高，脑脊液细胞学分类以淋巴细胞为主，脑电图及CT等表现以及抗病毒药物(更昔洛韦)治疗有效，提示病毒感染。从患者病史、临床表现等各方面综合分析可能以呼吸道传播为主。从病人的临床症状和流行特点来看，与常见的病毒性脑炎不同。2003年该研究室曾对该时段发生的脑炎进行过病毒分离，电镜形态学观察为(120-270)nm颗粒、有包膜呈螺旋对称结构，PCR得到的电泳条带未能得到与病毒有关的序列。这种病原体到底是一种新病毒，还是一种常见病毒的异位感染?其研究结果都将对于研究病毒的变异规律、流行病学特征、一般形态和结构特征、生物学特点、检测及临床治疗、预防新发“轻型脑炎”具有重要的意义。 目的： 从“轻型脑炎”患者脑脊液标本中分离病毒，探讨分离到的病毒与常见病毒性脑炎病原学的生物学关系。 方法： 从“轻型脑炎”患者中采集脑脊液。对标本进行分离培养，出现病变的标本连续传代，观察感染细胞的病变特性，电镜观察其形态结构，根据细胞生物学特性、形态学观察结果分析和缩小病毒种属研究范围，用黄病毒属单克隆抗体-ELISA方法检测与乙型脑炎病毒的关系，用血球凝集试验探讨病毒是否有凝集素，采用副粘病毒科病毒和肠道病毒属、甲病毒属、黄病毒属的各自通用引物，进行RT-PCR检测，通过以上实验对新发“轻型脑炎”进行病原学分析。 1.标本来源：济南市儿童医院的病人脑脊液42份，发病年龄为(3-8)岁，主要来自郊区和附近农村。 2.病毒分离：将脑脊液滤菌后接种于单层Hep-2细胞上，加维持液，37℃、5％C02温箱培养，逐日观察细胞病变，并拍照记录。 3.分离病毒的电镜观察：收集病毒细胞培养物，分别做沉淀、差速离心和超速离心，滴网，用1％磷钨酸负染色后做透射电镜观察。 4.病毒培养物的毒力滴定：将次代培养物做10倍比稀释后依次接种于96孔板孔内已长成单层的Hep-2细胞上，于37℃、5％℃O2温箱培养，逐日观察细胞病变，用中性红染色，用分光光度计在540nm波长测定OD值，按Reed-Muench法计算病毒TCID50。 5.血球凝集试验：将病毒培养液做倍比稀释后，与等量5％雄鸡红血球混合，室温静止45min后观察血球凝集现象。 6：黄病毒属单克隆抗体ELISA检测病毒抗原(交叉连续稀释法)：将病毒培养物以1：20、40、80、160横向包被酶标板，同时纵向重复4孔，将单抗以1：10-2、10-3、10-410-510-610-7分别加入不同浓度包被的酶标板中，同时设计有其他病毒对照，显色后用酶标仪检测A450值，P/N≥2.1判断阳性。 7.RT-PCR检测：从资料获取肠道病毒属、甲病毒属、黄病毒属的各自通用引物(共三对)，根据Genebank查得副粘病毒科F基因的核酸序列，利用引物设计软件PrimerPremier5，设计合成四对引物进行RT-PCR，从而确定病毒的属种。 1)提取总RNA：病毒增殖物沉渣100μl，加GIT变性液、NaAC、水饱和酚、氯仿、异丙醇，提取RNA。 2)逆转录反应：在上述标本中加入逆转录酶、逆转录反应体系、下游引物，逆转录生成cDNA。 3)PCR扩增：在模板cDNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶，经过变性(denaturation)、退火(annealling)、延伸(extention)共35个循环，获取cDNA的扩增产物。 4)电泳鉴定：用Mark作标记，鉴定目的cDNA的存在，利用数码凝胶图像分析系统(KodakDigitalscience1D)进行图像分析。 结果： 1.病原学分离：标本接种于Hep-2细胞(3-5)天后，与正常细胞对照组比较，病变细胞出现肿胀、变圆、脱落现象。 2.电镜观察发现有病毒样颗粒、空壳颗粒直径在(80-120)nm之间，规则、圆形，有包膜，核心为螺旋对称结构。 3.血球凝集试验：分离到的4株病毒培养物均未发生血球凝集现象。 4.黄病毒属单克隆抗体ELISA检测：各病毒稀释度和单抗稀释度之OD值的P/N值均未出现≥2.1现象。 5.RT-PCR：用副粘病毒科引物进行的扩增、凝胶电泳，刘蕾蕾和无标记号标本得到不典型的条带；用其他引物扩增未得到目的条带。其他标本任何引物均无条带产生。 结论： 新分离的病毒与常见引起脑炎的病毒株在电镜形态学上有显著差异，生物属性与DNA病毒、肠道病毒属、黄病毒属、甲病毒属无关，与含有血凝素者病毒无关(血球凝集试验阴性)，与呼吸道合胞病毒无关(PCR阴性)；PCR出现不典型条带结果提示不能完全排除副粘科病毒。是否由副粘病毒科变异株引起的“新发脑炎”有待进一步研究。