幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）是一种微需氧、螺旋状革兰阴性杆菌，主要感染定植于人体胃粘膜。流行病学调查显示，全球50%以上人口都曾感染过H.pylori，其感染可导致慢性胃炎，继而引起消化性溃疡和粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤（MALT），甚至与胃腺癌的发生发展密切相关，已被WHO列为Ⅰ类致癌因子。尽管H. pylori感染能够引发宿主较强烈的固有免疫和获得性免疫应答，但自然感染H. pylori后机体的免疫反应并不能有效清除细菌，反而由于慢性持续性感染导致胃粘膜免疫病理损害。目前，H. pylori慢性持续性感染机制及相关的免疫调控机制并不完全清楚。T淋巴细胞免疫在H. pylori感染所致疾病的发展进程具有重要的作用。根据TCR双肽链构成的不同，可将T细胞分为β T细胞和γ T细胞两类。 β T细胞作为重要的效应细胞在获得性免疫应答中发挥主要作用，而γ T细胞由于其分布特点和抗原识别特性，在机体的固有性免疫中发挥着独特的作用。γ T细胞主要分布于肠道、呼吸道皮肤及泌尿生殖道的黏膜和皮下组织，而脾脏和淋巴结中分布较少，外周血中γ T细胞仅占T淋巴细胞的2%～5%。粘膜组织是病原微生物入侵机体的第一道屏障，机体T细胞总库存的一半都在粘膜组织内。因此，γ T细胞这一分布特点提示其在细菌，病毒，真菌和原虫等病原体感染的黏膜免疫防御中都扮演着重要的角色。γ T细胞在胃肠道粘膜大量存在，而胃粘膜正是H. pylori感染定植的主要部位，是细菌入侵的第一道免疫防线。因此，γ T细胞与H. pylori感染的关系日益受到重视，其免疫应答状况极可能决定了H. pylori的感染定植及相关疾病的转归。已有研究报道，H. pylori感染患者外周血中的γ T细胞明显增高，并且与胃炎严重程度密切相关，清除细菌后，γ T细胞数量亦相应减少。然而，γ T细胞在H. pylori感染中的应答规律;对细菌感染定植的具体作用;对H. pylori感染诱导的免疫应答的调节机制等，目前还不清楚。明确这些问题将有助于我们对H. pylori感染过程中免疫应答网络的全面理解和阐述，为采取正确的免疫调控方式逆转其慢性持续化进程提供新的线索。【研究目的】1.本研究以γ T细胞为主要研究对象，探讨其在H. pylori感染过程中的应答规律及特点。2.分析γ T细胞对H. pylori定植量和炎症程度的影响。明确其在H. pylori感染中的作用。3.探讨γ T细胞影响H. pylori感染定植的免疫调节机制4.初步分析H. pylori感染患者外周血γ T细胞特点【研究方法】1．H．pylori感染过程中γ T细胞的应答特征建立H. pylori感染C57BL/6小鼠模型，在H. pylori感染后不同时间点处死小鼠，分离小鼠的脾，Peyer’s结，肠系膜淋巴结及小肠上皮间淋巴细胞，采用流式细胞技术，分析γ T细胞的应答规律及表型特征。细胞内因子染色，检测γ T细胞分泌细胞因子谱。同时，利用IL-23p19^-/-敲除小鼠研究IL-23对IL-17⁺γ T细胞的调节作用。2．γ T细胞在H. pylori感染中的作用研究H. pylori感染野生型小鼠及γ T细胞基因敲除小鼠，采用real-time PCR检测H.pylori定植量的变化，H&E染色检测胃组织炎症程度。随后，体外扩增分选感染小鼠脾脏中的γ T细胞。在H. pylori感染前24小时，通过静脉过继免疫TCR--/-小鼠，检测其对细菌定植量及胃组织炎症的影响。3. γ T细胞在H. pylori感染中的作用机制探讨H. pylori感染野生型小鼠及γ T细胞基因敲除小鼠，采用流式细胞技术，分析γT细胞缺失后机体Th细胞免疫应答变化；抽提感染胃组织RNA，real-time PCR检测细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶（MMPs）变化，ELISA检测感染小鼠血清及胃粘膜局部IgG和IgA抗体水平。4. H. pylori感染患者外周血中γ T细胞分析收集新桥医院消化内科H. pylori阳性（25例）和H. pylori阴性（18例）胃炎患者的外周血标本。采用流式细胞技术，分析γ T细胞比例变化及细胞亚群应答情况。【研究结果】1. γ T细胞在H. pylori感染过程中的应答特征1.1感染H. pylori后，小鼠系统及局部免疫系统中γ T细胞应答明显增强，小鼠脾及肠系膜淋巴结中的γ T细胞的比例在感染H. pylori24h后即开始明显升高（P <0.05），48h达到高峰。而PP结及肠上皮间淋巴细胞中γ T细胞于感染后24h即达到峰值，并且在感染早期（7d）都维持在较高水平。1.2体外以H. pylori感染小鼠脾脏CD3⁺T淋巴细胞。结果显示，H. pylori活菌可明显诱导γ T细胞扩增（P <0.05），而甲醛固定菌株则不能诱导增殖。并且H. pylori这种诱导扩增活性与H. pylori毒力蛋白CagA和UreB无关。1.3分析γ T细胞表型特点发现，H. pylori感染后，脾脏中γ T细胞表现为激活状态，CD44，CD69和CD25的表达上调。1.4采用流式细胞技术检测应答γ T细胞的不同亚型，尽管Vγ1⁺γ T细胞是脾淋巴细胞中主要的γ T细胞亚型，但H. pylori感染小鼠的脾淋巴细胞中主要以Vγ4⁺γ T细胞应答为主，其比例明显升高。而相应的Vγ1⁺γ T细胞所占比例降低（P <0.05）。采用real-time PCR检测胃粘膜局部γ T细胞的Vγ亚型，结果表明小鼠胃粘膜主要以Vγ7⁺γ T细胞为主。H. pylori感染后Vγ7水平略微升高，同时Vγ4⁺γ T细胞在胃粘膜聚集，可检测到明显的Vγ4基因表达。1.5采用流式细胞技术检测H. pylori感染小鼠应答γ T细胞的细胞因子谱，结果表明，γ T细胞分泌IL-4，IL-10及IL-22的水平较低，主要以分泌IL-17和IFN-γ为主，其中感染后IL-17⁺γ T细胞的比例明显升高，48小时达到顶峰，且一直维持较高水平（P <0.01）。而IFN-γ⁺γ T细胞感染前后无显著变化。并且，IL-17⁺γ T细胞是H. pylori感染早期主要的IL-17来源。结果提示，γ T细胞可能通过分泌IL-17参与了H. pylori感染的免疫应答。1.6H. pylori感染过程中γ T细胞分泌IL-17依赖于IL-23的表达。2. γ T细胞在H. pylori感染中的具体作用2.1H. pylori分别感染野生型及γ T细胞敲除小鼠，结果显示敲除小鼠胃粘膜H.pylori定植量及组织炎症程度均显著高于野生型小鼠（P <0.05）。提示γ T细胞在H.pylori可能发挥免疫保护性作用。2.2我们采用体外扩增的γ T细胞过继免疫TCR--/-小鼠后再感染H. pylori，检测细菌定植量和胃组织炎症的变化。与HBSS处理组相比，过继免疫组H. pylori感染后胃粘膜H. pylori定植量及组织炎症程度均显著降低（P <0.05）。结果进一步证实了γT细胞在抵御H. pylori感染定植中的保护性作用。3. γ T细胞在H. pylori感染中的作用机制研究3.1采用流式细胞技术分析了H. pylori感染后野生型小鼠与敲除小鼠的适应性免疫应答（Th细胞）的变化。结果显示，敲除γ T细胞后，Th17和Th22细胞的特异性免疫应答增强，而Th1和Th2型细胞免疫应答则减弱。胃粘膜组织real-time PCR结果也显示，敲除小鼠感染H. pylori后，IL-17水平在感染早期较野生型小鼠低，而在感染后期（28d），其水平则显著升高。感染后期的IFN_-γ表达则明显减弱。提示，γ T细胞可能通过影响后续的适应性免疫应答参与了H. pylori感染的免疫保护效应。3.2感染早期γ T细胞敲除小鼠胃粘膜中性粒细胞趋化相关的细胞因子及趋化因子（CXCL1, CXCL2, IL-6, GM-CSF, TNF-）水平降低。提示γ T细胞可能通过分泌IL-17诱导中性粒细胞的募集控制H. pylori早期感染的增殖扩散。3.3分析了H. pylori感染后野生型小鼠与敲除小鼠血清及胃粘膜的IgG和IgA抗体水平。结果显示，γ T细胞敲除后，血清IgG水平无明显改变（P>0.05），而粘膜局部的IgA水平则明显减低（P <0.05）。说明γ T细胞在粘膜局部抗体的产生过程中发挥一定作用。3.4γ T细胞缺失后，感染小鼠胃组织中趋化因子CCL2，CCL25及CXCL1的表达与野生型小鼠相比显著升高（P <0.05），而CCL28的表达则明显减低（P <0.05）。其他趋化因子CCL5，CCL20和CXCL2表达并无明显改变（P>0.05）。3.5敲除γ T细胞后， H. pylori感染小鼠胃组织MMP-9的表达显著升高,MMP-7的表达则明显减低（P <0.05），其他MMP-2，MMP-3和MMP-13的表达没有显著变化。以上结果提示我们γ T细胞可能通过影响部分MMP及趋化因子的表达参与H.pylori感染后的免疫调控及炎症反应。4. H. pylori感染患者外周血中γ T细胞分析γ T细胞在H. pylori感染和未感染患者外周血中的比例并无明显变化（P>0.05）。然而，相对于H. pylori阴性患者，H. pylori感染患者外周血中产IL-17和IL-22的γ T细胞比例明显升高（P <0.05）。并且外周血中存在IFN-γ，IL-17⁺或IL-22⁺共表达的γ T细胞。【主要结论】1. H. pylori感染后可以迅速激活诱导γ T细胞应答。PP结及iIEL是H. pylori感染后较早应答的免疫场所。应答的γ T细胞主要是Vγ4亚型，并且以分泌IL-17的γT细胞为主，这类IL-17⁺γ T细胞主要依赖于IL-23的表达。2. γ T细胞在H. pylori感染中主要发挥免疫保护性作用。3.早期应答的γ T细胞可能通过影响H. pylori特异的适应性免疫应答（细胞免疫和体液免疫），调节部分MMP以及趋化因子的表达参与了H. pylori的定植量及炎性反应强度的控制。4. H. pylori感染患者外周血γ T细胞比例无显著变化，但IL-17⁺γ T细胞明显升高，提示γ T细胞可能通过分泌IL-17参与了机体的免疫应答。【研究意义】H. pylori感染的免疫机制研究以前主要集中在慢性持续性感染诱导的适应性免疫应答反应，而感染初期的固有免疫系统的作用并不完全清楚。γ T细胞作为连接固有免疫和适应性免疫系统的重要桥梁，在感染性疾病中发挥重要作用。深入了解这群细胞在H. pylori感染中的作用及免疫调控机制有助于全面阐述H. pylori感染慢性持续化致病机制，为采取正确的免疫调控方式逆转其慢性持续化进程提供新的线索。