研究背景及目的近年来,细胞治疗、基因治疗已成为心血管疾病治疗的一类重要方法,并越来越受到重视。监测活体内移植入细胞的分布、增殖、迁移的方法虽然有多种,但传统方法都需要在离体状态下进行组织学切片分析和鉴定,无法准确地观察植入细胞的生长分化情况,从而难以对干细胞移植术的疗效作出客观评价。这显然难以满足干细胞移植已进入临床应用的现状,因此,无创、可多次重复应用的活体检测方法已成为迫切需要解决的问题。随着分子生物学的发展,已可从细胞分子水平阐述疾病机制,成像技术也已向细胞分子水平发展。自1999年分子影像学的提出,移植细胞的监测进入了崭新的阶段,人类开始能够在细胞分子水平评价活体组织细胞的生物学过程。较之于同位素检查,利用MR来监测移植细胞的最大优点是组织及空间分辨率高,可多序列、多角度成像,能很好显示软组织的解剖结构。由于MR成像无法区分移植细胞和靶组织细胞,为使移植细胞能在MR上特异性显示,目前广泛使用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxid, SPIO)作为负性标记物标记移植细胞,进行MR体外和活体内的成像研究。因为铁是顺磁性物质,可以使MR的T2WI和T2*WI图像的靶区信号均明显降低,产生负性对比剂的效应,从而经SPIO标记的移植细胞团也就可因含铁颗粒而显示为低信号,这样就间接反映了移植细胞的分布和聚集情况。本实验采用MR进行标记细胞的体外失踪及心肌梗死后移植细胞的活体内示踪,旨在明确SPIO体外标记兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的适当浓度和不同标记浓度对细胞的生物学活性影响,以及经MR成像的特征和可成像的最低标记细胞量等;尝试在常规1.5T MR的成像条件下,对较小动物兔的心肌进行解剖成像和移植细胞的进一步示踪;动态观察移植细胞在心肌内的活体成像特点及规律,为临床干细胞移植治疗心肌缺血性疾病的疗效观察与研究开创新方法。实验方法(1)MSCs的培养及鉴定。取兔骨髓,对MSCs进行常规分离、纯化和培养,观察细胞在光镜下的生长特征并记录其生长曲线,对所获得的细胞进行表面抗原(CD34和CD44)的检测,确定所获细胞绝大多数为MSCs。经透射电镜观察MSCs的超微结构。(2)MSCs具有向心肌细胞诱导分化能力的鉴定。观察5-aza诱导后横纹肌α-actin免疫细胞荧光染色结果,采用Western blot法检测MSCs诱导后横纹肌α-actin的表达变化。对诱导后的细胞特点进行透射电镜观察。(3)标记细胞的体外成像。以不同浓度SPIO标记MSCs,观察不同标记浓度对细胞生物学活性的影响,包括细胞增殖能力及形态的改变和生长曲线的变化;确定孵育时间和细胞标记率;明确SPIO标记干细胞的适当浓度阈值并经MR证实可成像的最低细胞量和最佳细胞量。(4)移植细胞的心肌内注射及MR活体示踪。制备兔急性心肌梗死模型,将SPIO标记的MSCs移植注入梗死心肌内,经MR动态观察移植细胞的定位、存活及迁徙。并经超声心动图在移植前、后测定左心功能,评价细胞移植的疗效,最后经组织学检查验证标记细胞在心肌内的存活及迁徙。实验结果(1)骨髓单个核细胞悬液接种后24h开始有细胞贴壁,且摇晃瓶身贴壁细胞不易脱落。初期的贴壁细胞多为球形或短梭形,72h完全换液后可见贴壁细胞分裂增殖。(2)对贴壁生长的MSCs进行流式细胞仪检测,提示传代的细胞均一性较好,表面抗原CD34表达阴性,CD44表达阳性的细胞均在95%以上,说明得到的是比较纯化的MSCs。(3)SPIO可有效标记MSCs,二者共同孵育24h后的标记率在95%以上。且细胞对铁颗粒的吸收与细胞的数量、标记浓度和孵育时间呈正相关。20～50μg Fe/ml培养液是SPIO标记干细胞的适当浓度阈值,在该标记浓度下细胞的生物学活性不受影响。超过50μg Fe/ml培养液浓度可使细胞的变形增殖能力受到不同程度的抑制。(4)SPIO标记的MSCs在T2WI尤其是T2WI/FFE序列信号明显降低;在35μg Fe/ml培养液标记浓度下,MR可成像的最低细胞量为5×104;35μg Fe/ml培养液浓度时,标记细胞1×105～5×104 MR成像既可使T2WI、T2WI/FFE图像信号均降低,而且没有使靶灶扩大的磁敏感伪影。(5)MR T1WI、T2WI、T2WI/FFE序列均可清晰成像示踪梗死心肌内注射的标记MSCs,以FFE最为敏感,标记细胞的定位、存活及迁徙均可在MR表现。MR可对标记细胞示踪至注射后3W,而T2W低信号可维持至注射后2W左右,T1W则仅能示踪1W左右。各注射点的信号减低测量结果符合MR成像所见,并经统计学验证。(6)移植细胞注射前、后对兔梗死心肌的超声心动图检查证实,MSCs移植入心梗边缘区后4w心脏功能有一定恢复,与心梗后即刻相比,左室收缩期室壁增厚率显著提高(P<0.05),左室壁运动幅度增加,左室射血分数提高,左室舒张末期容积缩小。(7)组织学检查证实注射入梗死心肌与正常心肌交界处的MSCs存活,并在移植后4W的组织学检测中发现了移植细胞的融合迁徙。结论联合采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法易于分离、纯化获得纯度较高的MSCs。体外采用5-aza诱导下有部分MSCs向肌细胞分化,证实MSCs为多潜能干细胞,具有表达肌细胞的特异性功能。SPIO可以简便标记MSCs并在适当浓度下对MSCs的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2WI/FFE序列可敏感显像磁性标记的干细胞。临床型1.5T MR可对兔梗死心肌内的标记细胞进行无创性活体示踪,并较长时间地动态观测细胞的存活与迁徙。MSCs注射的部位是其向心肌细胞分化及心功能改善关键的影响因素,应将MSCs投送到有存活心肌的梗死边缘区,使其与存活心肌细胞直接接触而向肌细胞分化。