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目的双酚A（Bisphenol A,BPA）和壬基酚（4-Nonylphenol,NP）是典型的环境内分泌干扰物,一系列的研究已经证明双酚A和壬基酚对雄性生殖系统有不良影响。本项目以SD大鼠为研究对象,将其分别暴露于低浓度的双酚A、壬基酚以及两者的混合物,研究其对睾丸间质细胞（Leydig cells）生物化学成分的影响,并探讨双酚A和壬基酚对Leydig细胞的影响是否具有多代（multigenerational）或跨代（transgenerational）效应。为今后进一步证实内分泌干扰物的多代或跨代表观遗传效应提供理论依据,为预防男性不育症的研究提供新的思路。方法将72只雌性和24只雄性SD大鼠分开喂养,在28日龄时开始进行灌胃暴露处理。分别设置四个暴露组:对照组,BPA组,NP组,BPA&NP联合暴露组,因BPA和NP难溶于水且具有脂溶性,故选择玉米油为溶剂,对照组为溶剂对照组;暴露剂量如下:玉米油（溶剂）、BPA（0.5 mg/kg）、NP（5 mg/kg）和BPA&NP（0.5mg/kg BPA+5 mg/kg NP）,隔日一次。如图1所示(P14),在暴露4周后,将每个小组中的雌鼠和雄鼠以3:1的比例单独进行合笼交配,在此期间继续给予暴露液直至分娩。在F0代雌鼠分娩后将亲代雌雄分开,雌鼠继续暴露,直到哺乳期结束;亲代雄性大鼠继续暴露至90日龄,此代雄鼠被称为F0+♂。暴露的时间间隔涵盖了大鼠睾丸发育和生精周期的全部阶段。在哺乳期结束后,将F0代分娩所产生子一代大鼠均分为两部分,一部分停止暴露,这部分被称为F1-;另一部分在哺乳期结束后继续暴露,这部分称为F1+。将F1+的大鼠持续暴露至56日龄,然后将它们合笼交配（排除同窝交配）。F1+的雌性大鼠在怀孕期间持续暴露直至分娩（泌乳期间不暴露）。F1+的雄性大鼠继续暴露至90日龄,它们被称为F1+♂。F1+大鼠交配所产生的第一代和第二代都未再继续暴露,这两代分别被称为F2-,F3-。然后将F2-和F3-的雄性大鼠正常喂养至90日龄,分别命名为F2-♂和F3-♂。分别取F0+,F1+,F1-,F2-和F3-代中90日龄雄性大鼠的睾丸和血清,将睾丸称重用来计算睾丸的脏器系数;采用H&E染色观察睾丸间质组织形态结构的改变;采用油红染色观察间质组织中脂滴含量的变化;进行透射电镜检测睾丸间质细胞超微结构的改变;采用傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform infrared spectroscopy,FTIR）检测和分析睾丸间质组织中生化大分子的改变;采用ELISA法测定血清中睾酮的水平。结果1.在用BPA,NP和BPA&NP暴露后,与对照组相比,F1+三个不同处理组的睾丸脏器系数显着降低（P<0.05）;但在F0+,F1-,F2-和F3-代中,BPA,NP和BPA&NP处理的大鼠睾丸的脏器系数与相应对照组相比无显着差异。2.组织病理学的结果显示,与对照组相比,F0+和F1+代中的BPA组,NP组和BPA&NP组大鼠睾丸间质组织中空泡数量有增加。具体来说,与BPA组或NP组相比,BPA&NP组间质组织中有更多的空泡,但是在F1-,F2-和F3-代中,睾丸间质组织的HE染色结果未发现三个实验组和对照组之间有明显变化。油红染色的结果显示,在未直接暴露的后代F1-,F2-和F3-代中,BPA组,NP组和BPA&NP组中的红褐色脂滴面积与相应对照组相比有减少。3.电子透射显微镜的结果显示,与对照组相比,F0+代中的BPA组,NP组和BPA&NP组的Leydig细胞中线粒体略有肿胀;滑面内质网也显示出明显的扩张;此外联合暴露于BPA&NP会诱导形成具有液泡状水样结构的自噬体,且溶酶体的数量也有所增加。在F1+代中,BPA组,NP组和BPA&NP组的线粒体肿胀和内质网肿胀程度似乎与对照组相比更加明显;同时与F0+代的暴露组相比,F1+代的暴露组中溶酶体数目也有明显的增加。此外,在F1+代的BPA&NP组中观察到严重的细胞间质水肿。F2-代的BPA&NP组表现出核内陷,而F2-代的BPA组或NP组也都表现出了间质水肿。在F3-代中,BPA组、NP组和BPA&NP组中观察到多发的线粒体异（如肿胀、线粒体嵴消失等）,同时伴随着间质水肿和溶酶体增多。此外与对照组相比,每一代的暴露组都出现了更明显的染色质紊乱和边集现象。4.用ELISA法检测出各代大鼠血清中睾酮含量,结果显示在F0+,F2-,F3-代中,暴露于BPA、NP和BPA&NP的大鼠血清中的睾酮含量与对照组相比未见明显差异。而直接暴露于其中的F1+代中,三个不同暴露组血清中睾酮含量与对照组相比都有着明显的降低;未直接暴露的F1-和F2-代中,除了F1-代的NP组外,其余的暴露组与相应的对照组相比血清睾酮含量也出现了明显的降低。5.对各代睾丸间质组织的FTIR光谱分子指纹区域(1800-900 cm-1)数据进行分析,结果显示在F0+,F1+,F1-,F2-和F3-代中,暴露组和对照组之间存在着明显的聚簇分离,进一步分析发现引起分离的主要生化改变是酰胺I,酰胺II,核酸和脂质等。在上述进行检测的各代中,与相应的对照组相比,BPA和NP单独暴露及联合暴露都会导致酰胺I与酰胺II的比率发生显着差异（P<0.05）。BPA暴露会导致各代之间Leydig细胞的转录翻译调控（P<0.001）和DNA氧化损伤（P<0.05）两个指标有显着变化;NP的暴露会导致未直接暴露的F2-和F3-代中Leydig细胞出现DNA氧化损伤和转录翻译调控的改变（P<0.001）。F0+和F1+代直接暴露于BPA,NP和BPA&NP,可以显着降低未直接暴露的F1-,F2-和F3-代的Leydig细胞中的脂质蓄积（P<0.001）。结论1.长期暴露于低剂量的BPA、NP及BPA&NP会导致Leydig细胞的蛋白质二级结构、基因的转录调控、DNA的氧化损伤以及细胞中脂质水平发生改变;2.低浓度的BPA和NP不仅会对直接暴露于其中的大鼠Leydig细胞结构、生化改变（Biochemical alteration）和血清睾酮水平有影响,且这些影响还可能会在未直接暴露的后代中多代甚至跨代发生。3.此研究的结果可为今后进一步证实内分泌干扰物多代或跨代表观遗传效应提供理论依据,为预防男性不育症研究提供新的思路。