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目的本课题选取双组分信号转导系统VraSR为切入点,探索VraSR调控表皮葡萄球菌生物膜形成及药物敏感性的分子机制,旨在为临床控制表皮葡萄球菌引起的感染提供理论依据及发现潜在的药物靶标。方法1.表皮葡萄球菌vraSR互补突变株的构建:以表皮葡萄球菌临床分离株（Staphylococcus epidermidis strain 1457,SE1457）基因组DNA为模板,PCR扩增vraSR基因,酶切后连接至载体p CN51质粒,连接产物转化大肠杆菌。重组质粒p CN51-vraSR经PCR、酶切和测序鉴定正确后电击转化至金黄色葡萄球菌RN4220,再转入表皮葡萄球菌SE1457 vraSR敲除突变株（ΔvraSR）中,获得vraSR互补突变株ΔvraSR（p CN51-vraSR）。同时,以空质粒p CN51为对照,构建空载对照株ΔvraSR（p CN51）。表皮葡萄球菌SE1457 vraSR敲除突变株（ΔvraSR）是利用质粒p KORI在野生株SE1457基础上通过同源重组技术获得的,由本实验室保存。2.表皮葡萄球菌生物表型实验:利用微量平板半定量法检测表皮葡萄球菌SE1457及其同源性vraSR突变株生物膜形成能力,试管稀释法检测表皮葡萄球菌的药物敏感性;菌落计数（CFU）检测表皮葡萄球菌的存活及对环境压力（万古霉素、SDS、H2O2、Triton X-100）的耐受性。通过Triton X-100诱导的自溶实验及qRT-PCR定量检测表皮葡萄球菌生物膜基质中胞外DNA（e DNA）释放量,分析ΔvraSR突变株生物膜降低的原因。刚果红吸收实验以及透射电镜观察细菌细胞壁形态进一步探索表皮葡萄球菌SE1457及其同源性vraSR突变株细胞壁的完整性;通过观察细菌在不同时间（24h、48h、72h、96h）和不同浓度（50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L、400μg/m L）的刚果红平板上吸收刚果红的能力可以检测细菌细胞壁的通透性。3.VraSR调控表皮葡萄球菌生物膜形成及药物敏感性的分子机制探索:对数生长期细菌经环境胁迫因子（万古霉素、氨苄青霉素、氯霉素、H2O2、SDS）处理30min,抽取表皮葡萄球菌SE1457及vraSR敲除突变株RNA样品,采用qRT-PCR分析表皮葡萄球菌SE1457vra S/vra R转录水平变化,以探索VraSR可能感应的环境胁迫因子;转录组测序（RNA-seq）分析表皮葡萄球菌SE1457及ΔvraSR突变株的差异表达基因,结合SE1457与ΔvraSR突变株的表型差异,对受VraSR调控的疑似靶基因（与生物膜形成及药物敏感性相关的基因）进行qRT-PCR验证。Ni-NTA柱层析纯化表皮葡萄球菌SE1457重组融合蛋白VraR（His6-VraR）,利用凝胶阻滞实验（EMSA）分析反应调节蛋白VraR与疑似靶基因启动子区之间的相互作用。结果1.PCR及测序结果显示重组质粒p CN51-vraSR构建成功,qRT-PCR提示ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补突变株中vraSR转录水平是SE1457野生株的1.8倍。2.敲除vraSR对表皮葡萄球菌生物学表型的影响:（1）通过微量平板半定量法检测表皮葡萄球菌生物膜形成情况,SE1457野生株在6h、12h、24h、48h生物膜的形成量(OD570)分别为1.74±0.10、2.45±0.20、2.74±0.11和2.82±0.15;ΔvraSR突变株生物膜的形成量较SE1457野生株显著降低（P<0.01）,在上述4个观察时间点ΔvraSR突变株生物膜的形成量(OD570)分别为0.81±0.07、1.22±0.1、1.71±0.05和1.76±0.10;ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补突变株生物膜的形成量接近SE1457野生株水平,在上述4个观察时间点ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补突变株生物膜的形成量(OD570)分别为1.36±0.06、1.80±0.04、2.31±0.17和2.79±0.09;ΔvraSR（p CN51）空载株生物膜形成量与ΔvraSR突变株类似。qRT-PCR定量检测表皮葡萄球菌生物膜基质中胞外DNA（e DNA）释放量(ng/OD600),结果显示ΔvraSR突变株和ΔvraSR（p CN51）空载株24小时生物膜中的e DNA的相对浓度比SE1457野生株和ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补株高2倍。（2）试管稀释法检测表皮葡萄球菌SE1457及其同源性vraSR敲除突变株的药物敏感性,结果显示SE1457野生株对万古霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素的敏感性（MIC值）分别为4μg/m L、0.5μg/m L、8μg/m L和8μg/m L;ΔvraSR突变株对上述4种抗生素的敏感性（MIC值）分别为1μg/m L、0.25μg/m L、8μg/m L和8μg/m L;ΔvraSR突变株对作用于细胞壁抗生素（万古霉素与氨苄青霉素）的药物敏感性（MIC值）较SE1457野生株显著增高,对卡那霉素和氯霉素的敏感性两者无显著差异。将p CN51-vraSR互补至ΔvraSR突变株后能回复其对万古霉素和氨苄青霉素的药物敏感性,ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补突变株对上述4种抗生素的敏感性（MIC值）分别为4μg/m L、0.5μg/m L、8μg/m L和8μg/m L;然而,电击转化p CN51空载质粒对ΔvraSR突变株药物敏感性无影响,ΔvraSR（p CN51）空载对照株对上述4种抗生素的敏感性（MIC值）分别为1μg/m L、0.25μg/m L、8μg/m L和8μg/m L。（3）分光光度计(OD600)测定表皮葡萄球菌生长曲线,SE1457野生株与ΔvraSR突变株生长无明显差异。菌落计数（CFU）检测表皮葡萄球菌的存活及对环境压力（万古霉素、SDS、H2O2、Triton X-100）的耐受性。结果显示,在振荡培养8h、12h、24h、48h后表皮葡萄球菌SE1457野生株CFU计数分别为1.52×109、2.19×109、3.23×109、3.18×109;ΔvraSR突变株CFU计数分别为1.19×109、1.02×109、5.6×108、1.21×108;ΔvraSR突变株活菌数（CFU）明显低于SE1457野生株（P<0.05）。采用菌落计数（CFU）分析表皮葡萄球菌对环境压力（万古霉素、SDS、H2O2、Triton X-100）的耐受性,结果显示表皮葡萄球菌分别在万古霉素压力下暴露72h、在阴离子去垢剂SDS压力下暴露48h以及Triton X-100压力下暴露48h后,ΔvraSR突变株的耐受性显著降低,并且未检测到活菌,SE1457野生株与ΔvraSR突变株对氧化压力H2O2的耐受性无显著差异。通过Triton X-100诱导细菌自溶的方法检测表皮葡萄球菌SE1457及ΔvraSR突变株自溶的差异,结果显示SE1457野生株在振荡3h后自溶率为34%,ΔvraSR突变株在振荡3h后自溶率为74%,ΔvraSR突变株的自溶率显著高于SE1457野生株。刚果红吸收实验检测SE1457野生株与ΔvraSR突变株细胞壁的完整性,结果显示随着培养时间和刚果红浓度的增加,与SE1457野生株相比,ΔvraSR菌落中央较红,吸收刚果红量增加。透射电镜观察培养至稳定期的SE1457野生株、ΔvraSR突变株以及ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补株的细胞壁形态并测量细菌细胞壁厚度,结果显示与SE1457野生株相比,ΔvraSR突变株细胞壁表面较粗糙,细胞壁有间断情况;SE1457野生株细胞壁厚度为37.93±7.2μm、ΔvraSR突变株细胞壁厚度为29.79±2.8μm（P<0.01）、ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补株细胞壁厚度为35.04±4.52μm;ΔvraSR（p CN51-vraSR）互补株的表型均回复至野生株水平,ΔvraSR（p CN51）空载对照株的表型均与ΔvraSR突变株类似。3.VraSR调控表皮葡萄球菌生物膜形成及药物敏感性的分子机制探索:（1）qRT-PCR分析表皮葡萄球菌SE1457 vraSR在环境胁迫因子作用下的转录水平。结果显示,在10倍MIC浓度万古霉素和氨苄青霉素作用下,vraSR转录水平上调约4.8倍和7.2倍;在阴离子去垢剂SDS作用下,vraSR转录水平上调约7倍。然而,在氯霉素、氧化压力（H2O2）、热（42℃、45℃）和高渗（1.5%Na Cl）作用下,vraSR转录水平没有明显改变。结果提示VraSR选择性对作用于细胞壁的抗生素（万古霉素、氨苄青霉素）及SDS有反应,VraSR可能在表皮葡萄球菌适应外界环境压力中发挥作用。（2）转录组测序（RNA-seq）分析表皮葡萄球菌SE1457及ΔvraSR突变株的差异表达基因,结果发现共有314个差异表达基因,其中有249个基因表达水平上调、65个基因表达下调。qRT-PCR验证结果显示,?vraSR突变株中与生物膜形成相关的基因ica A转录水平下调约2倍,ica R上调约4倍;与药物耐受性相关的基因lrg A转录水平下调约10倍、cid A上调约2倍,与糖代谢相关的基因gnt K下调约10倍、glp D下调约2倍;与磷酸戊糖途径相关的基因sdh A上调约2倍;而直接与葡萄球菌耐药有关基因,如糖基转移酶基因（stg B）、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖1-羧乙烯基转移酶1基因（mur AA）、UDP-N-乙酰壁氨酰丙烯酰胺-D-谷氨酸-2%2C6-二氨基甲酸连接酶基因（mur E）、青霉素结合蛋白基因（pbp2）的转录水平无明显改变,提示VraSR不直接调控表皮葡萄球菌的药物敏感性。（3）凝胶阻滞实验（EMSA）分析表皮葡萄球菌反应调节蛋白VraR与疑似靶基因启动子区之间的相互作用。凝胶阻滞实验（EMSA）证明了磷酸化的VraR-P蛋白能与vraSR、ica、lrg AB、cid A基因的启动子区结合,VraR-P不能与pbp2、stg B、mur E、mur AA基因的启动子区结合。结论表皮葡萄球菌VraSR存在自我调控机制,能选择性对细胞壁胁迫因子有反应;VraSR通过调控ica操纵子的转录促进表皮葡萄球菌生物膜形成,并通过调控Cid A-Lrg A系统增强表皮葡萄球菌在环境胁迫因子下的存活,进而间接影响表皮葡萄球菌对作用细胞壁抗生素（万古霉素、氨苄青霉素）的药物敏感性。