祛风化痰解毒方及其拆方调节食管癌EC9706细胞PLC-γ1-PI3K信号转导的研究

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目的:通过观察不同制备方法所得的祛风化痰解毒方及其拆方:祛风方、化痰方、解毒方对人食管癌细胞EC9706增殖的抑制、细胞周期及蛋白PLCγ1、PKCα、PI3K的影响,研究活血、解毒、化痰的方法治疗食管癌的机理,寻求有效的的药物制备方法,探讨“风邪、痰、毒”与食管癌发生的分子生物学机制。方法:备选中药分别采用采用醇提法和水煮醇沉的方法制备药物,用MTT法筛选出各药物及不同的制备方法对人食管癌细胞EC9706抑制的影响,选出抑制率较高且出膏率高的药物,根据《中药学》药物功效初步分为祛风方、化痰方、解毒方;运用正交实验设计选出最佳的药物组合;分别用祛风方、化痰方、解毒方及祛风化痰解毒合方作用于细胞EC9706,在倒置显微镜下观察各组对其生长状态和增殖的影响;采用流式细胞术检测各组药物对细胞生长周期的作用及影响;用Wertern blot测试活血方、解毒方、化痰方及合方组对食管癌细胞EC9706中PLCγ1、PKCα、PI3K蛋白表达的影响。结果:①备选药物中出膏率较高且利用MTT法检测出对人食管癌细胞EC9706抑制作用明显且药效明显的有水煮醇沉法制备的常山、蟾皮,醇提法制备的蝉蜕、土荆皮、皂角、斑蝥,出膏率依次为蟾皮>皂角>斑蝥>土荆皮>常山>蝉蜕,抑制作用大小排列依次为常山皂角>常山>蟾皮>斑蝥>蝉蜕>土荆皮。②依据药物筛选结果和药物功效,对药物初步拟定为祛风方、化痰方、解毒方,根据正交实验设计得出最佳组合的祛风化痰解毒全方。③祛风化痰解毒方及其拆方干预人食管癌细胞EC9706,在倒置显微镜下观察可见各组药物对细胞的形态改变明显;各组药物不同的剂量和作用时间对细胞的抑制作用不同,存在剂量依赖性和时间效应关系,抑制作用大小依次为化痰解毒活血方>化痰方>解毒方>祛风方。④各治法组G0/G1期细胞比率均有所下降,祛风组下降显著;各药物组的S期细胞比率均有下降,其中祛风组和解毒下降比率较大;各药物组G2/M期细胞比率升高,其中祛风组G2/M期细胞比率升高显著,⑤用Wertern blot可以检测到人食管癌细胞EC9706中PLCγ1、PKCα、PI3K蛋白呈高表达状态,使用祛风方、化痰方、解毒方、全方干预细胞,发现各方对高表达蛋白有不同程度的抑制作用,其中全方效果最为显著,化痰方次之,解毒方较低。结论:①祛风化痰解毒方及其拆方能显著地抑制食管癌细胞的增殖,祛风、化痰、解毒药物相互配伍可以协同并增强抑制食管癌细胞的增殖。②化痰组和全方组将细胞阻滞在G1/G0期,解毒组和祛风组将细胞阻滞在G2/M是抑制食管癌细胞增殖的重要因素。③调节食管癌中PLCγ1、PKCα、PI3K蛋白的表达状态是祛风化痰解毒方及其拆方抑制食管癌细胞增殖的关键机制。④从祛风化痰解毒方及其拆方的药物作用效果可以推测,在食管癌病变发生机制中,“风邪、痰、毒、”与PLCγ1、PKCα、PI3K蛋白的高表达状态关系密切。
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