前言淋巴循环(lymph circulation)是循环系统的重要辅助部分,它可将肾组织间隙中多余的液体、淋巴细胞、电解质和蛋白质运送回血液系统,对于维持体液稳定起着重要作用。关于淋巴循环的研究已有300余年的历史,但是其研究进展远远落后于其他系统。我们现在已经明确了淋巴管及淋巴结的分布及走行,对淋巴的组成及调节有了测定,初步建立了淋巴循环的体系,但是对于淋巴管的发生、形态、功能及调节的认识还远远不够。可以说,与循环系统及神经系统相比,淋巴系统并未引起人们足够的重视。在肾脏移植手术中,淋巴管往往不予以结扎。此外,很多临床疾病及临床操作如炎症、肿瘤、创伤及外科手术等亦可以损伤淋巴循环。对于淋巴循环的有限认识有碍于医学的发展。目前淋巴循环的研究已经逐渐起步,关于心、脑、肝及胃肠等器官淋巴循环障碍的报导已见报端,但是关于肾脏淋巴循环障碍的研究甚少。早期研究表明,肾门淋巴管急性结扎对肾功能有显著影响。此外,胸导管结扎可以导致肾实质弥漫性硬化。但是我们对于肾淋巴管的了解依然有限,而且在肾移植手术中,淋巴管的重要性常被忽略。我们的前期研究发现肾淋巴管结扎后大鼠出现肾功能不全、蛋白尿及肾小管上皮细胞凋亡,但是其作用机制仍待进一步研究。慢性肾脏衰竭的进展主要表现为肾脏细胞丢失及肾脏细胞被细胞外基质及成纤维细胞取代。近年来,凋亡已被证实参与肾脏细胞丢失过程。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡,是机体的一种正常细胞的更新和异常细胞清除,而在病理状态下异常的凋亡又与众多系统疾病的发生发展密切相关。众所周知,凋亡是一个复杂的过程,主要有两条途径——内源性途径和外源性途径。内源性凋亡途径又称线粒体／细胞色素C (cytochrome c,Cytc)途径,线粒体是细胞生命活动的控制中心,它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心,还是细胞凋亡调控的中心。当线粒体受到细胞内损伤如氧化应激时,内源性途径被激活。Bcl-2家族促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白比例增高,线粒体膜的通透性增加。细胞色素C释放入胞浆并激活下游细胞凋亡途径,最终激活“执行caspase"—caspase3,从而诱导细胞凋亡。外源性凋亡途径又称为死亡受体通路,是由胞外肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族的死亡配体引发的。肿瘤坏死因子家族配体如Fas受体(Fas ligand,FasL)结合到其受体上并激活caspase8,继而激活下游“执行caspase",比如caspase3,导致细胞凋亡。我们已经证实肾淋巴管结扎后大鼠出现肾小管上皮细胞凋亡,那么在这个过程中两条凋亡途径起着什么样的作用呢?其凋亡的机制又如何呢?为了阐明肾淋巴管结扎与肾脏疾病进展、肾脏细胞凋亡的关系以及哪些基因和蛋白参与其中,我们以肾淋巴循环障碍的单肾切除大鼠为模型,做了以下研究。目的1.构建肾淋巴循环障碍大鼠模型；2.观察肾淋巴循环障碍对大鼠的影响；3.探讨肾淋巴循环障碍所致肾小管上皮细胞凋亡的机制。研究方法1.动物模型建立：选取250-300g雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠,适应性喂养7天。54只大鼠随机分为三组：KL组(n=18),KN组(n=18)及sham组(n=18)。动物处理如下：KL组大鼠,切除右肾并结扎左肾肾门淋巴管及左肾上下极脂肪纤维组织；KN组大鼠,手术步骤同前,只是不结扎淋巴管;sham组大鼠,开腹后随即缝合,不结扎肾脏淋巴管亦不切除肾脏。肾淋巴管结扎方法简介如下：在外科显微镜下于肾被膜下及肾实质内注射2%Evans蓝,淋巴管显示清楚后结扎肾门淋巴管及肾上下极脂肪纤维组织。各组大鼠分别于术后第1、7、14天各处死6只。收取。肾脏标本、24小时尿液及血标本。2.苏木素伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色：肾脏组织在4%多聚甲醛中固定,经常规脱水、石蜡包埋后制成4μ m厚切片。取石蜡切片经脱蜡、水化、HE染色、脱水、透明、封片后在显微镜下观察。3.细胞凋亡检测：组织切片制作处理方法如上,使用肾脏细胞原位凋亡(TUNEL)试剂盒进行凋亡检测,所有操作均按照产品说明书进行。每张玻片任选10个独立高倍视野计数凋亡细胞,每100个细胞内的凋亡细胞数以百分数表示为细胞凋亡指数。4.肾脏氧化应激检测：选取新鲜肾脏组织,提取组织蛋白并并用Bradford法测定蛋白浓度,采用相应ELISA试剂盒检测肾脏组织活性氧(ROS)产生水平,测定450nm及620nm处吸光度,以620nm处吸光度为参照；丙二醛(MDA)测定采用硫代巴比妥酸法,测定532nm处吸光度后根据公式进行计算；超氧化物歧化酶(SOD)活性检测采用黄嘌呤氧化酶法,测定550nm处吸光度后根据公式进行计算；所有操作均按照试剂说明书进行。5.实时荧光定量PCR检测：肾脏组织置于RNA保护液中保存,采用Trizol法提取肾脏组织总RNA,ABI7500机器实时荧光定量检测Bax、Bcl-2、FasL和Gapdh的mRNA表达。Gapdh用作管家基因。6. Western blot检测：取肾脏新鲜组织,采用组织总蛋白提取试剂盒提取肾脏组织总蛋白,Western blot检测Bax、 Bcl-2、FasL蛋白表达水平；采用胞浆蛋白提取试剂盒提取肾脏组织胞浆蛋白,Western blot检测细胞色素C(cytc)的蛋白表达水平。7. caspase8、caspase9及caspase3的活性检测：采用相应活性检测试剂盒检测caspase8、caspase9及caspase3活性。取新鲜组织,按照产品说明书制作组织裂解液,加入反应体系孵育后测定405nm处吸光度,根据标准曲线进行计算。8.统计学分析：采用SPSS17.0软件包进行统计分析,组间均数的比较采用方差齐性检验与单因素方差分析,定量数据用均数士标准差(x士s)表示,检验水平α=0.05。结果1.肾脏功能变化：Sham组的肾功能在整个实验中没有明显变化,与之相比,KL组及KN组尿蛋白及血肌酐水平自术后第7日起明显增高(P<0.05)。术后第14日,KN组尿蛋白及血肌酐水平回落至正常水平,与sham组相比无明显差异,而KL组的尿蛋白及血肌酐水平则继续增高(P<0.01)。2.苏木素伊红(HE)染色：HE染色表明KL组有明显的肾小管上皮细胞退化、脱落及萎缩现象；而KN组类似组织改变不如KL组明显；sham组未见上述组织改变。3.凋亡检测：Sham组中罕见凋亡细胞；KL组细胞凋亡指数从术后第1日起开始增多(P<0.05)并在术后第14日达到顶峰(P<0.01)；KN组细胞凋亡指数自术后第7日明显增高(P<0.05),之后维持在较高水平(P<0.05),并未进一步增高。与KL组相比,KN组各时间点细胞凋亡指数均较低(P<0.05)。4.肾脏ROS、MDA及SOD水平：与sham组相比,KL组ROS水平自术后第1日起开始增高并维持在一个较高的水平(P<0.05),术后第7日起KL组肾脏MDA水平增高(P<0.05)而SOD活性水平降低(P<0.05)。而KN组与sham组相比,以上指标在各时间点未见明显异常。5. Bax、Bcl-2、 FasL基因表达：实时荧光定量PCR结果显示,与sham组相比,KL组Bax及FasL mRNA表达水平自术后第1天起明显增高(P<0.05)并在术后第14天达到高峰(P<0.01),而Bcl-2mRNA表达水平自术后第1天起明显降低(P<0.05)并一直低于sham组(P<0.01)。与sham组相比,KN组Bax及Bcl-2mRNA表达水平无明显变化；而FasL mRNA表达水平自术后第7日起明显高于sham组(P<0.05),但仍低于KL组(P<0.05)。6. Bax、Bcl-2、cytc及FasL蛋白表达：Western结果显示,与sham组相比,KL组Bax、cytc及FasL蛋白表达水平自术后第1天起明显增高(P<0.05),而Bcl-2蛋白表达水平自术后第1天起明显降低(P<0.05)。与sham组相比,KN组FasL蛋白表达水平自术后第7天起明显增高(P<0.05),但仍低于KL组(P<0.05)。而KN组的Bax、 cytc及Bcl-2蛋白表达水平与sham组相比无明显差异。7. caspase8、caspase9及caspase3的活性：与sham组相比,KL组caspase8、caspase9及caspase3的活性自术后第一日起增高并保持在较高水平(P<0.05)。KN组caspase8活性自术后第7日起较sham组明显增高(P<0.05),但仍低于KL组(P<0.05)。而KN组caspase9及caspase3的活性与sham组相比无明显变化。结论1.我们证实了肾脏淋巴循环障碍可以导致肾脏功能减退及肾脏细胞凋亡,凋亡主要发生在肾小管上皮细胞处。2.我们探讨了肾脏淋巴循环障碍所致肾小管上皮细胞凋亡的机制,可能与肾淋巴循环障碍导致的氧化应激有关,而且内源性和外源性凋亡途径同时参与了此凋亡过程。提示了肾脏淋巴循环在维持肾小管形态及功能中的作用。前言近年来,慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)的发病率明显增加。从1988年至2002年,美国终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的发病率由每年39.4／百万人口上升至98.3／百万人。该数据在未来的10年中仍将以每年4.1%的幅度增高。在我国,1999年全国透析移植登记报告的数据显示当年新进入透析的患者占透析患者总数的41.7%,并保持着增高的态势。美国第三次全国健康与营养调查结果显示,在总的CKD患者中,ESRD仅占0.6%,也就是说,有更多的相对早期的患者存在。对于非常多的慢性肾功能不全疾病来说,我们找不到它们确切的病因,这也就导致了临床有效治疗手段的缺乏。因此,找到肾脏损害的危险因子并予以早期干预是非常必要的。与循环系统及神经系统不同,淋巴管并未引起人们的重视,淋巴管在外科手术中不会予以吻合,临床诸多操作亦会伤及淋巴管。目前已有淋巴循环障碍在其他如心脏、脑、胃肠等系统的作用影响的报道,但关于其中肾脏的报道少见。肾移植是终末期肾病(end stage of renal disease,ESRD)的一种有效的治疗手段,但是其面临着供肾短缺和移植肾后期功能丧失两大难题。在肾移植患者中,长期的存活状况不容乐观。慢性移植物肾病(chronic allograft nephropathy,CAN)是晚期肾移植体功能不全的主要原因,也是远期移植肾失败的主要原因之一,依其严重程度分为Ⅰ-Ⅲ级。CAN产生的具体原因尚不清楚,就目前的研究结果而言,许多免疫或(和)非免疫因素都可以导致CAN的发生。免疫抑制剂已在临床上广泛足量应用以预防排斥反应,但仍不能有效预防CAN,目前也没有任何免疫抑制剂能治疗CAN的报道。因此,对于其非免疫因素的研究是非常具有临床意义的。我们的早期研究表明,肾淋巴管结扎后大鼠肾脏出现肾间质纤维化及肾小管萎缩。根据‘’Banff97"的标准,肾间质纤维化及肾小管萎缩是CAN的主要标志。。我们的结果还显示在肾小管及肾间质中TGF-β1表达量增高。而TGF-β1和其他细胞因子在CAN的发生发展过程中起着重要的作用。因此我们设想肾淋巴循环障碍可能是引起CAN的一个因素。肾间质纤维化是所有慢性肾脏疾病的共同特征之一,是肾脏疾病发展到肾功能不全的一个过程,肾纤维化与间质成纤维细胞活化成为胶原蛋白分泌纤维母细胞有关。然而,有些研究表明,除此之外,纤维母细胞还能来源于肾小管上皮细胞及内皮细胞,这个过程是通过上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchvmal transition,EMT)产生的。EMT是肾间质纤维化的一个病理过程。EMT是一种转分化的变种,也是损伤组织中成纤维细胞形成的一个公认的机制。在这个过程中,上皮细胞转化为基质重塑细胞。这些上皮细胞失去它们的上皮极性、细胞粘附分子、细胞-细胞和细胞-基质之间的连接。这个过程也伴随着间充质细胞标志物(比如波形蛋白、纤连蛋白、平滑肌肌动蛋白和N-钙粘蛋白)的出现以及上皮细胞标志物(如E-钙粘蛋白)的丢失。资料表明TGF-β1是引起EMT的最重要的一个因子,BMP-7则可以有效地抑制TGF-β1介导的EMT。尽管关于肾间质纤维化与EMT的研究已经比较多见,但是肾淋巴循环障碍是否可以引起EMT的发生以及TGF-β1等在其中的作用尚未有研究。结合我们的前期研究结果,我们假设EMT参与了此病理过程,并进行了进一步研究论证。此外,有研究表明,血管紧张素Ⅱ(angi otensinⅡ, AngⅡ)存在于肾淋巴管中,而AngⅡ对于EMT的产生起着一定的作用,是EMT发生的一个主要的推动力量。那么当肾淋巴管结扎后,肾脏AngⅡ是否增高,它对于EMT是否起着一定的作用呢?为了解决以上问题,我们设计了以下实验。目的1.观察肾淋巴循环障碍对大鼠肾脏纤维化的影响；2.探讨EMT是否参与肾淋巴循环障碍所致大鼠肾脏纤维化的病理过程；3.探讨肾淋巴循环障碍所致大鼠肾脏纤维化的机制。研究方法1.动物模型建立：选取250-300g雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠,适应性喂养一周。36只大鼠随机分为两组：KL组(n=18)及KN组(n=18)。动物处理如下：KL组大鼠,切除右肾并结扎左肾肾门淋巴管及左肾上下极脂肪纤维组织；KN组大鼠,手术步骤同前,只是不结扎淋巴管。肾淋巴管结扎方法简介如下：在外科显微镜下于肾被膜下及肾实质内注射2%Evans蓝,淋巴管显示清楚后结扎肾门淋巴管及肾上下极脂肪纤维组织。各组大鼠分别于术后第14、28、56天各处死6只。留取肾脏组织标本、24小时尿液及血标本。2.Masson染色及PAS(Periodic Acid-Schiff stain)染色：肾脏组织在4%多聚甲醛中固定,经常规脱水、石蜡包埋后制成4μm厚切片。Masson染色取石蜡切片经脱蜡、苏木精染色、masson立春红酸性复红液染色、苯胺蓝液染色、脱水、封片后在显微镜下观察。PAS染色取石蜡切片经脱蜡、过碘酸液染色、Schiff染液染色、苏木素染色、冲洗、封片后在显微镜下观察。3.电镜检测：将大鼠麻醉,开腹摘取肾脏,选取皮髓交界处切割标本,约1mm3大小,迅速投入2.5%戊二醛中固定。经脱水、包埋、固化后使用超薄切片机切片,3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色,然后进行透射电镜观察。4.肾脏氧化应激检测：选取新鲜肾脏组织,提取组织蛋白并并用Bradford法测定蛋白浓度,采用相应ELISA试剂盒检测肾脏组织活性氧(ROS)产生水平,测定450nm及620nm处吸光度,以620nm处吸光度为参照；丙二醛(MDA)测定采用硫代巴比妥酸法,测定532nm处吸光度后根据公式进行计算；超氧化物歧化酶(SOD)活性检测采用黄嘌呤氧化酶法,测定550nm处吸光度后根据公式进行计算；所有操作均按照试剂说明书进行。5.实时荧光定量PCR检测：肾脏组织置于RNA保护液中保存,采用Trizol法提取肾脏组织总RNA,ABI7500机器实时荧光定量检测FSP1, BMP7,αSMA, E-cadherin及Gapdh的mRNA表达。Gapdh用作管家基因。6. Western blot检测：取肾脏新鲜组织,采用组织总蛋白提取试剂盒提取肾脏组织总蛋白,Western blot检测FSP1, BMP7, αSMA和E-cadherin的蛋白表达水平。7. AngⅡ血管紧张素Ⅲ型受体(Angiotensin Ⅱ Type1Receptor, ATIR)肾素、活化肾素的检测：采用相应Elisa检测试剂盒检测AngⅡ、血管紧张素Ⅲ型受体(AngiotensinⅡ Type1Receptor, AT1R)、肾素、活化肾素。取新鲜组织,制作组织匀浆,按照产品说明书进行操作,测定450nm处吸光度,根据标准曲线进行计算。8. TGF β1、p-smad2/3检测选取相应Elisa检测试剂盒检测,操作同上。9.统计学分析：采用SPSS17.0软件包进行统计分析,组间均数的比较采用单因素方差分析,定量数据用均数士标准差(x士s)表示,检验水平α=0.05。结果1.肾脏功能变化：KN组尿蛋白及血肌酐水平各时间段变化不明显。与KN组相比,KL组尿蛋白及血肌酐水平自明显增高(P<0.01)。2.Masson染色及PAS染色：Masson染色表明KL组有局造性肾小管上皮细胞刷状缘脱落、空泡变性、管腔扩大、部分细胞崩解脱落；PAS染色表明KL组有肾小管上皮细胞刷状缘脱落,空泡变性,管腔扩大,部分肾小管细胞崩解脱落,裸基底膜形成。而KN组类似组织改变不明显。3.电镜检测：KN组肾小管上皮细胞外观保存完好,表现出丰富的线粒体和薄基底膜环绕。而KL组肾脏表现出不规则的皱缩的基底膜、上皮细胞肿胀及极性改变。KL组肾脏的小管间区域有类似成纤维细胞的纤维基质扩张及毛细血管破坏。透射电镜下可见肾小管上皮细胞内原纤维出现以及突破基底膜游离到肾间质中的趋势。4.肾脏氧化应激检测：与KN组相比,KL组保持较高水平的ROS和MDA水平,而KL组SOD水平则在较低水平。说明KL组存在着氧化应激现象。5.实时荧光定量PCR检测：与KN组相比,KL组大鼠肾脏FSPl、α SMA的mRNA水平增高,而E-cadherin、BMP7水平则降低。FSP1,α SMA, E-cadherin为EMT的标志物,其变化证明了EMT的发生。6. Western blot检测：与KN组相比,KL组大鼠肾脏FSPl、α SMA的蛋白水平增高,而E-cadherin、 BMP7水平则降低。FSP1,α SMA,E-cadherin为EMT的标志物,其变化证明了EMT的发生7.AngⅡ AT1R、肾素、活化肾素的检测：与KN组相比,KL组肾脏AngⅡ水平增高,而AT1R、肾素、活化肾素则没有明显变化,说明肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)未被激活,RAS没有参与肾淋巴循环障碍所致的肾脏纤维化过程。8. TGFβ1、p-smad2/3检测Elisa结果显示,KL组肾脏TGF β1、p-smad2/3水平增高,说明TGFβ1-smad途径参与了肾淋巴循环障碍所致的肾脏纤维化过程。结论1.我们证实了肾脏淋巴循环障碍可以导致肾脏功能减退及肾脏纤维化；2.EMT是肾淋巴循环障碍导致肾脏纤维化的一个途径；3.我们探讨了肾脏淋巴循环障碍所致肾脏纤维化的机制,TGF β1-smad途径参与了纤维化及EMT过程,而RAS没有参与这个过程。前言近年来慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)在我国的发病率逐年增高,在医疗和经济上显得越来越重要。我国慢性肾脏病的发病率约为11%,其中约1%的患者会发展为终末期肾功能衰竭(end stage renal disease,ESRD),每位患者透析治疗费用高达十万元左右,那么国家用于肾衰竭透析治疗的费用将高达数十亿元甚至将近百亿元,加上用于治疗此疾病的前期费用以及治疗此疾病并发症的费用,总数惊人。而其耗费的医疗资源也是非常巨大的。因此,CKD的防治非常重要。但是,至今为止,临床常规治疗对于病人的存活状况、生活质量以及费用的影响尚不清楚。关于此疾病的进展、治疗以及变异的可靠信息也远远不够。沉默信息调节因子2(silent information regulator2,sir2)是在酵母细胞中被发现的一种依赖烟碱胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的组蛋白去乙酰化酶。哺乳动物sir2同源蛋白家族sirt有7个SIRT类似物,分别是沉默信息调节因子相关酶1~7(sirtl~sirt7),每个蛋白都有不同的作用靶点和细胞定位。Sirt家族蛋白在进化上高度保守,广泛存在于原核生物和真核生物中,它们通过NAD依赖的酶催化活性在细胞应激反应(如双链DNA损伤、细胞循环、凋亡等)中起着重要作用。近五年来对于sirt3的研究成为热点,越来越多的学者将sirt3视为一个能调节代谢及氧化应激的线粒体sirtuin。Sirt3是一种NAD+依赖的去乙酰化酶,具有去乙酰基酶活性,定位在11号染色体,基因长度为21kb,在肌肉、肝脏、心脏、肾脏和褐色脂肪等组织中高度表达。长链sirt3存在于线粒体、细胞质和细胞核中,短链sirt3仅存在于细胞的线粒体中。线粒体sirt3在细胞能量代谢、氧化应激、细胞凋亡等方面发挥着重要作用。Sirt3可以通过降低细胞内ROS水平、干预氧化应激来对组织起到一定的保护作用,这也许可以成为一个新的作用靶点。但是目前sirt3对于组织的保护作用研究较少,主要集中在脂肪组织、心肌、神经系统上,在肾脏中的报道少见。已有的关于肾脏与sirt3的报道也只是局限在细胞实验方面,并未对动物进行过完整的基因干预。我们前期研究证实,肾淋巴循环障碍可以导致大鼠肾脏功能不全,而在这个过程中氧化应激起着一定的作用。这对于研究sirt3在肾脏中的作用来说是一个合适的动物模型。Sirt3可以降低细胞内ROS水平,对衰老相关疾病如心脑血管疾病和神经退行性疾病等具有保护作用,如若能够研究出其在肾脏中的作用,则可以将其作为一个全新的分子靶点,对于肾脏病的防治起到重要的作用。目的1.探求sirt3对肾脏的作用,以期为肾脏病的防治开拓出新的靶点；2.简单讨论sirt3对肾脏作用的机制。方法1.动物模型建立：选取250-300g雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,适应性喂养一周。72只大鼠随机分为四组：KL组(n=18)、Lenti组(n=18)、GFP组(n=18)及sham组(n=18)。动物处理如下：KL组大鼠,切除右肾并结扎左肾肾门淋巴管及左肾上下极脂肪纤维组织；Lenti组大鼠,手术步骤同前,术后第7天自尾静脉注射5×107TL慢病毒介导的过表达sirt3质粒(Lenti-sirt3);GFP组大鼠,处理同Lenti组,只是注射GFP标记的阴性对照慢病毒颗粒；sham组大鼠,开腹后随即缝合,不结扎肾脏淋巴管亦不切除肾脏。肾淋巴管结扎方法简介如下：在外科显微镜下于肾被膜下及肾实质内注射2%Evans蓝,淋巴管显示清楚后结扎肾门淋巴管及肾上下极脂肪纤维组织。各组大鼠分别于术后第7、14、28天各处死6只。留取肾脏组织标本、24小时尿液及血标本。2.肾脏氧化应激检测：选取新鲜肾脏组织,提取组织蛋白并并用Bradford法测定蛋白浓度,采用相应ELISA试剂盒检测肾脏组织活性氧(R0S)产生水平,测定450nm及620nm处吸光度,以620nm处吸光度为参照；丙二醛(MDA)测定采用硫代巴比妥酸法,测定532nm处吸光度后根据公式进行计算；超氧化物歧化酶(SOD)活性检测采用黄嘌呤氧化酶法,测定550nm处吸光度后根据公式进行计算；所有操作均按照试剂说明书进行。3.实时荧光定量PCR检测：肾脏组织置于RNA保护液中保存,采用Trizol法提取肾脏组织总RNA, ABI7500机器实时荧光定量检测caspase3、 collagen I、 sirt3、 Gapdh的mRNA表达。Gapdh用作管家基因。4. Western blot检测：取肾脏新鲜组织,采用组织总蛋白提取试剂盒提取肾脏组织总蛋白,Western blot检测caspase3、 sirt3、 collagen I蛋白表达水平。5.免疫组化：肾脏组织在4%多聚甲醛中固定,经常规脱水、石蜡包埋后制成4μ m厚切片。石蜡切片经抗原修复、一抗孵育、二抗孵育后制成相应的免疫组化切片。在显微镜下观察。阴性对照使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)。6.统计学分析：采用SPSS17.0软件包进行统计分析,组间均数的比较采用方差齐性检验与单因素方差分析,定量数据用均数士标准差(x士s)表示,检验水平α=0.05。结果1.临床指标与对照组相比,其余三组大鼠血肌酐及尿蛋白水平从术后第7天起均增高并在术后第28天达到顶峰。与KL组相比,Lenti组大鼠血肌酐及尿蛋白水平自术后第14天起较低。而GFP组大鼠与KL组大鼠相比临床指标无明显差异。2.氧化应激水平与对照组相比,KL组、GFP组及Lenti组ROS及MDA水平从术后第7天起均增高并在术后第28天达到顶峰。与KL组相比,Lenti组大鼠MDA水平自术后第14天起较低。与对照组相比,KL组、GFP组及Lenti组SOD水平从术后第7天起逐渐降低。Lenti组大鼠SOD水平与KL组相比自术后第14天逐渐增高。与KL组大鼠相比,GFP组大鼠各项指标无明显差异。3. Caspase3, collagen I及sirt3的基因表达与对照组相比,KL组、GFP组及Lenti组大鼠caspase3及collagen I水平从术后第7天起均增高并在术后第28天达到顶峰。与对照组相比,KL组sirt3水平自术后第7日逐渐降低。与KL组大鼠相比,GFP组大鼠各项指标无明显差异。Lenti组大鼠sirt3水平与sham组相比在术后第7日降低,但是术后第14日增高,术后第28日降低到正常水平。与KL组相比,Lenti组大鼠caspase3及collagen I水平自术后第14日起开始降低,而sirt3水平自术后第14日增高并维持在较高水平。说明在注入sirt3过表达的慢病毒后7日,sirt3在Lenti组中的表达增高,而这种增高可以降低caspase3及collagen I的表达水平。4. Caspase3, collagen I及sirt3的蛋白表达KL组、GFP组及Lenti组大鼠caspase3及collagen I水平与对照组相比从术后第7天起增高并在术后第28天达到顶峰。与对照组相比,KL组sirt3水平自术后第7日逐渐降低。与KL组大鼠相比,GFP组大鼠各项指标无明显差异。Lenti组大鼠sirt3水平与sham组相比在术后第7日降低,但是术后第14日增高,术后第28日降低到正常水平。与KL组相比,Lenti组大鼠caspaseS及collagen I水平自术后第14日起开始降低,而sirt3水平自术后第14日增高并维持在较高水平。其结果与基因表达结果相似。5.免疫组化Sham组中caspase3表达少见。而KL组、GFP组中可见明显的caspase3表达,主要分布在肾小管里边。Lenti组caspase3表达亦主要分布在肾小管里,但是其表达与KL组、GFP组相比减弱。在正常组中,sirt3主要分布在肾小管里,而KL组、GFP组中sirt3的表达几乎见不到。在进行sirt3过表达干预后,Lenti组的sirt3水平与KL组相比明显增高。免疫组化结果显示collagen I在sham组中几乎不表达。与之相反,collagen I在KL组、GFP组表达明显,主要分布在肾间质。Lenti组中collagen I的表达较正常组较高,但是与KL组、GFP组相比表达降低。结论1.Sirt3对于肾脏起着保护作用。2.Sirt3的保护作用与减少组织氧化应激有关系。3.该实验研究较局限,只是证实了sirt3在肾脏中的作用,但是对于其具体的作用机制研究不够充分。而且肾淋巴循环障碍大鼠本身的具体发病机制现在研究较少,尚无比较全面的认识,为了更好地研究sirt3的作用机制,可以将来选择研究较成熟的其他动物肾损害模型进行进一步研究。