[研究背景]目前仍然缺乏可以实现预期疗效的挽救终末期脏器功能衰竭的替代疗法。器官移植是迄今为止唯一有效的挽救患者生命的关键技术,而移植术后必然发生的针对移植物的免疫排斥反应是影响移植物长期存活的最大障碍。同种移植物免疫排斥反应是由多种免疫相关细胞因子参与,多种机制介导的复杂过程,主要是由于移植物供体及受体之间的主要组织相容性抗原(人类称之为人类白细胞抗原,Human Leukocyte Antigen,HLA,小鼠称之为H-2抗原)的不同所致。迄今为止,免疫抑制疗法仍然是临床接受器官移植患者应用的的控制排异反应的主要治疗方法,但是免疫抑制剂长期应用可导致机体抵抗力下降,诱发感染、恶性肿瘤等,严重影响移植物的长期生存。因此寻找适宜手段,实时动态监测移植物急性排斥反应,对移植排斥早期诊断和临床治疗方案及时选择和调整均具有重要理论和实际意义。目前临床诊断急性移植排斥反应的监测手段主要包括临床症状观察、外周血相关生化指标检测、移植物病理学活检和影像学检查等,其中移植物病理学活检是最可靠的手段,是“金标准”。但是病理学检查的侵入性、创伤性及潜在并发症等问题严重限制了其临床应用,而其他检测手段及指标普遍缺乏敏感性和特异性,难以早期发现病变。因此寻找移植物表达的新的靶向分子,选择新的非侵入性检测手段,尽早发现并实时监测移植排斥反应,对于改善器官移植受者预后,阐明移植排斥机理具有重要意义,这也是是移植免疫学领域迫切需要解决的关键问题。Toll样受体家族(Toll-like Receptor,TLRs)作为一种模式识别受体(Pattern Recognition Receptor,PRR),可特异性识别病原相关分子模式(Pathogen-Associated Molecular Pattern,PAMPs)。近年来的研究表明,Toll 样受体家族广泛表达于树突细胞、巨噬细胞等免疫细胞表面,某些TLR也选择性表达在 T 淋巴细胞上。TLR5(Toll-Like Receptor 5,Toll 样受体 5),是 TLRs 家族中唯一具有免疫负调节作用的分子,可参与自身免疫病、肿瘤等多种疾病的致病过程。细菌鞭毛蛋白(Flagellin)是TLR5唯一蛋白类配体。研究表明Flagellin-TLR5可激活NF-KB通路,最终激活NF-kB相关的前炎性细胞因子的分泌,引发一系列免疫应答反应,最终发挥免疫效应。也有报道指出,TLR5在调节性Tγ细胞上高表达,参与免疫负调节。本实验室前期研究表明,TLR5在同种移植小鼠模型的移植排斥高峰期高表达,体内应用免疫抑制剂雷帕霉素后,虽可以诱导同种移植耐受,但可以促进移植物TLR5高表达,TLR5表达与同种免疫耐受状态密切正相关,因此TLR5有可能成为移植免疫耐受状态下实时监测同种移植排斥的靶点。近来多个文献报道,雷帕霉素等现有的免疫抑制剂具有较严重的毒副作用,可引起肝肾等重要器官损伤,不利于移植受者预后,因此急需要研究探索新的免疫抑制剂抑制同种移植排斥反应。细胞周期蛋白依赖性激酶9(Cyclin-DependentKinase9,CDK9)是正向转录延伸因子(Positive Transcription Elongation Factor b,P-TEFb)激酶的组成成分,可磷酸化RNA聚合酶II,调控激活初始反应基因。大量研究报道显示CDK9在初始炎症基因激活以及控制炎性进程方面具有重要作用。既往研究表明,在同种移植排斥过程中,有大量炎性细胞和分子参与,因此有效限制炎症发展有可能显著抑制移植排斥,延长移植物生存期。鉴于既往研究已经证实同种移植排斥的本质是炎症反应,而CDK9与炎症发生发展密切相关,本实验室前期研究已经证明同种移植排斥高峰期TLR5高表达,因此推测抑制CDK9表达有可能影响同种反应T细胞的TLR5表达。本论文选择同种移植急性排斥模型,利用放射性核素碘125标记抗TLR5抗体,研究抑制T细胞CDK9是否影响同种移植物TLR5表达,是否影响同种移植物的生存;目的是阐明在CDK9抑制状态下,TLR5是否可以作为移植耐受状态下监测同种移植排斥的分子靶点实时监测同种移植排斥,同时也为利用CDK9抑制剂抗同种移植排斥提供实验基础。本论文通过两部分研究抑制CDK9对TLR5靶向监测同种异体移植排斥的影响。一是体外研究抑制同种移植排斥反应效应细胞CDK9对TLR5表达的影响;二是体内研究抑制同种移植排斥反应效应T细胞CDK9移植物生存期的影响及对TLR5靶向监测同种异体移植排斥显像的影响。第一部分抑制同种效应细胞CDK9对TLR5表达的影响及125I-anti-TLR5mAb 制备[研究方法]1.CCK-8法同种效应细胞增殖实验分别制备效应细胞(BALB/c小鼠脾细胞)和刺激细胞(经丝裂霉素处理的C57BL/6小鼠脾细胞),将二者进行混合淋巴细胞培养。实验分为对照组和CDK9抑制组(经CDK9抑制剂LDC000067处理),CCK-8法分别检测两组细胞增殖,状况。2.Western blot检测蛋白表达状况利用不同浓度CDK9抑制剂(LDC000067)处理细胞,检测同种反应效应细胞CDK9表达状况。结合对细胞增殖结果的分析,获得CDK9抑制的最佳抑制剂浓度。利用CDK9抑制最佳浓度的LDC000067处理同种反应效应细胞,检测TLR5表达状况。3.1251标记抗TLR5抗体的制备参照文献提供的方法进行常规标记:Iodogen法常规碘化标记、制备125I-anti=-TLR5mAb,并利用凝胶色谱柱SephadexG-25进行洗脱纯化,计算标记率。4.125I-anti-TLR5放射化学纯度及稳定性分析常规采用纸层析法测定125I-anti-TLR5 mAb的放射化学纯度以及比移值Rf(Retention Factor Value,Rf Value);选取标记物蛋白峰分别与生理盐水(NS,Normal Saline)、血清(Serum)混合均匀,利用纸层析法在各时间点(lh、24h、48h、72h、96h)测定标记物的放射化学纯度,分析不同时间点标记物的稳定性。5.125I-anti-TLR5 mAb与效应细胞结合及解离实验选择野生型BALB/c小鼠,常规分离制备单个脾细胞悬液,分为对照组(等量PBS)和CDK9抑制组(LDC000067,5μM),孵育6h后,调整好细胞浓度,将其分别与等量的标记物混合均匀,继续孵育。分别于0.5、0.75、3、6、24h用冷PB终止反应。将细胞收集后测量放射性计数(cpm值),计算结合率。解离实验的细胞制备及抑制剂处理方法同上。细胞孵育24h后,洗涤细胞后,用RPMI-1640重悬细胞,孵育至0.5、0.75、3、6、24h分别用冷PB终止反应,取上清,测量放射性计数(cpm值),计算解离率。[研究结果]1.CDK9抑制对同种反应脾细胞增殖的影响结果显示,不同浓度的CDK9抑制剂LDC000067处理后,均可抑制同种反应细胞增殖,抑制细胞增殖的最佳浓度为5μM。2.CDK9抑制对同种反应脾细胞TLR5表达的影响结果显示,与对照组相比,不同浓度下CDK9抑制剂LDC000067处理同种反应细胞后,CDK9表达量均有不同程度的降低,浓度为5μM时同种反应效应细胞CDK9表达量最低。通过分析效应脾细胞增殖反应结果,确定LDC000067抑制CDK9的最佳抑制浓度为5μM。利用5μM的CDK9抑制剂LDC000067处理同种反应脾细胞,Western Blot分析TLR5表达,结果显示,与对照组相比,抑制组TLR5表达明显增加。3.125I-anti-TLR5的标记率、放化纯及稳定性利用Iodogen法制备125I-anti-TLR5mAb,标记率为96.2%。利用纸层析法得出比移值Rf为0.11;同样此方法得出标记物在生理盐水(NS)和人血清(Serum)中稳定性高,至72h仍维持在90%以上,且二者之间无明显差异。4.125I-anti-TILR5与脾细胞结合及解离在实验所设定的各个时间点上,两组小鼠脾细胞与125I-anti-TLR5 mAb的结合均成上升趋势;但是在0.5～24h,抑制组均高于对照组;除了 0.25 h外,其余4个时间点两组间比较差异均具有统计学意义。两组细胞的解离率也随时间的延长逐渐增加,CDK9抑制组的解离率在各时间段均低于对照组,在0.25h、0.75h、24h,两组间比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。第二部分抑制效应T细胞CDK9对同种移植模型小鼠TLR5靶向监测移植排斥影响[研究方法]1.C57BL/6-BALB/c SCID小鼠同种皮肤移植模型的构建随机选取C57BL/6(B6,H-2b)小鼠(雌性,6-8周)作为供体;BALB/c-SCID(H-2d)小鼠(雌性,6-8周)作为受体,按照标准方法构建C57BL/6-SCID小鼠同种皮肤移植模型。术后3周,移植皮片部位生长出黑色毛发即为模型构建成功。2.分离纯化野生型BALB/c小鼠T细胞并分组按照常规方法分离野生型BALB/c小鼠脾细胞,并用Mouse T Cell Enrichment Column分离纯化T细胞。随后分别用LDC000067(5μM)或等量的PBS处理T细胞6h;收集细胞后,用生理盐水重悬,过继转输至已经构建好的C57BL/6-SCID模型小鼠,分别建立T细胞介导的同种异体移植CDK9抑制组(LDC000067处理组)和同种异体移植排斥对照组模型(分别简称为抑制组和对照组)。3.CDK9抑制对T细胞介导同种异体移植物生存影响分别向同种移植模型小鼠过继转输两组T细胞后,每日观察两组小鼠移植皮片的变化,直至对照组移植皮片完全排斥,记录生存期。4.同种皮肤移植模型125I-anti-TLR5mAb的体内生物学分布分析在对照组排斥高峰期,选取两组小鼠,3%NaI喂水24h封闭甲状腺,分别经尾静脉注射125I-anti-TLR5mAb,注射标记物72h后处死小鼠,分别收集小鼠血、移植皮片、对侧正常皮片以及肝、肾、心等重要器官、组织,称重后,测量放射性,计算每克组织百分之标准标记物注射量(%ID/g),研究125I-anti-TLR5mAb在两组小鼠的体内生物学分布状况以及靶非靶比值(移植部位/对侧正常皮片,Target/Nontarget,T/NTratio)。5.同种皮肤移植模型小鼠全身动态磷屏自显影显像于对照组排斥高峰期,随机选取对照组小鼠和抑制组小鼠,3%NaI喂24h常规封闭甲状腺。其中选取部分抑制组小鼠,在注射125I-anti-TLR5mAb前0.5h,尾静脉注射未标记抗TLR5抗体100μg/只,作为特异性阻断组。所有模型小鼠尾静脉注射125I-anti-TLR5mAb。分别于24、48、72h,麻醉并置于磷屏图像采集板,曝光20min,随后将采集板进行扫描得到图像,使用OptiQuantTM图像分析软件对图像进行对比分析。6.移植皮片HE(苏木素-伊红)及CDK9/TLR5免疫组织化学染色随机选取全身磷屏自显影显像后的对照组及抑制组模型小鼠,将移植皮片完整取下,置4%多聚甲醛溶液中固定,石蜡包埋、切片,按照常规方法进行HE(苏木素-伊红)染色,并利用相应的特异性抗体进行CDK9/TLR5的常规免疫组织化学染色,显微镜下观察、拍照。[研究结果]1.成功构建T细胞介导的C57BL/6-BALB/c SCID小鼠同种皮肤移植模型同种皮片移植术后7天拆包,移植皮片与受体小鼠移植床贴合,移植皮片柔软、湿润、无颗粒感,周围无红肿、无渗液等感染表现;移植手术后的第3周,移植部位可见黑色毛发,表明C57BL/6-BALB/c SCID小鼠同种皮肤移植模型构建成功。分别过继转输两组野生型BALB/c小鼠脾T细胞后,未见异常反应;20天左右对照组移植部位出现排斥反应,表明成功建立了 T细胞介导的C57BL/6-BALB/c SCID小鼠同种皮肤移植模型。2.CDK9抑制对T细胞介导同种异体移植物生存影响通过对模型小鼠移植皮片的观察和记录,结果显示对照组小鼠移植皮片平均生存期为(20±1.58)天,而抑制组小鼠移植皮片延长至(29±2.77)天。两者相比有统计学差异,P<0.05。结果提示T细胞CDK9抑制可以明显延长同种移植物的存活。3.125I-anti-TILR5mAb在模型小鼠的生物学分布两组小鼠尾静脉注射125I-anti-TLR5mAb,72h后处死后,进行模型小鼠的生物学分布研究,结果显示:两组小鼠肝、肾以及移植部位皮片均具有较高的放射性计数,但抑制组移植皮片的放射性计数明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。CDK9抑制组的T/NT比值(3.7±0.16)显著高于对照组(2.02±0.06),差异有统计学意义(P<0.05)。4.模型小鼠全身动态磷屏放射性自显影显像两组小鼠注射标记物48及72h后,对照组及抑制组小鼠均可见移植皮片明显显影;与对照组相比,抑制组小鼠显影更明显。而TLR5阻断组,移植皮片在所有时间点均无明显显影。OptiQuantTM图像分析可得,组别与时间有交互作用,且三组之间的差异有统计学意义(均P<0.05),48h时间点上,抑制组放射性活度比明显高于对照组(2.35±0.19vs.1.11±0.09,P<0.05);72h放射性活度比,与对照组(1.30±0.02)相比,抑制组(2.09±0.01)明显升高,而阻断组(1.09±0.04)明显降低,均具有统计学差异(P<0.05)。全身动态磷屏自显影显像结果与体内生物学分布结果一致。5.移植皮片HE(苏木素-伊红)染色及CDK9/TLR5表达状况由移植物HE染色结果可见,与对照组相比,抑制组移植皮片的炎性浸润明显减少,表明抑制T细胞CDK9可以明显减弱移植物炎症反应。移植物的免疫组化染色结果显示,与对照组相比,抑制组皮片的CDK9表达受到明显抑制,而TLR5表达则明显增强,表明CDK9抑制可以促进移植物TLR5表达。[研究结论]1.CDK9抑制剂可明显抑制同种反应效应细胞增殖,促进其TLR5表达;抑制移植排斥效应T细胞CDK9可明显延长同种异体移植物的生存期;移植物炎性浸润明显减少,而TLR5表达增加。2.成功制备125I-anti-TLR5mAb;抑制效应脾细胞CDK9,明显促进脾细胞TLR5与标记物125I-anti-TLR5mAb的亲和力。抑制T细胞CDK9,可明显促进125I-antj-TLR5mAb在T细胞介导的同种移植模型中移植物的局部浓聚,结果提示抑制CDK9有利于体内TLR5靶向同种异体移植急性排斥的监测。[创新点]1.CDK9抑制剂LDC000067可促进同种反应T细胞TLR5表达明显增高。2.抑制T细胞CDK9可促进125I-anti-TLR5 mAb同种移植物的局部浓聚,有利于TLR5靶向同种异体移植急性排斥监测。