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第一部分TrkB和E-cadherin在鼻咽癌组织中的表达、相关性及临床意义目的：鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是我国南方常见的恶性肿瘤,多为低分化鳞癌,具有恶性程度高,生长快,易早期转移等特点。研究证明,在上皮源性肿瘤中,肿瘤细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT),导致的肿瘤细胞从原发灶脱落是肿瘤发生侵袭转移的早期和关键步骤。酪氨酸激酶受体B (TrkB)为酪氨酸激酶受体家族成员,是脑源性神经受体因子(brain-derived neurotrophin factor, BDNF)的特异性受体。最新研究发现在人头颈鳞癌及结肠癌中TrkB的过表达可导致EMT的发生。本部分研究旨在探讨TrkB与EMT标志物细胞粘附分子上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)在NPC组织中的表达及之间的相关关系,以及它们与肿瘤临床特征和预后之间的关系。方法：采用免疫组化方法检测54例鼻咽癌组织和25例正常鼻咽上皮组织中TrkB蛋白、E-cadherin蛋白的表达水平,比较二者表达差异及之间关系。根据患者年龄、性别、原发灶大小、淋巴结转移、临床分期将病例分组,应用单因素方差分析研究TrkB以及E-cadherin的表达与肿瘤临床病理特征之间的关系,Logistic逐步回归分析法研究与淋巴结转移有关的预测因子。非线性相关分析两种蛋白的关系。结合临床随访资料,用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,比较TrkB高表达与低表达组；E-cadherin高表达组和E-cadherin低表达组5年生存率。结果：1.在鼻咽癌组织中,TrkB蛋白平均染色分数为137±39,E-cadherin蛋白平均染色分数为156±50,相比正常鼻咽上皮组织差异明显,有统计学意义(p<0.001)。2.TrkB表达与患者年龄(p=0.865)、性别(p=0.209)、肿瘤原发灶大小(p=0.622)无关,与淋巴结转移(p<0.001)和临床分期(p=0.007)有明显相关性。3.E-cadherin表达与患者年龄(p=0.328)、性别(p=0.149)、肿瘤原发灶大小(p=0.298)无关,与淋巴结转移(p<0.001)和临床分期(p=0.001)有明显相关性。4.E-cadherin的表达水平与TrkB的表达水平有显著的相关关系。5.除了肿瘤原发灶大小,TrkB表达水平(p<0.001)也可能是NPC淋巴结转移的预测因子。6.TrkB低表达组5年生存率高于TrkB高表达组,差异具有统计学意义(p=0.047),提示TrkB的过表达可能预示不良预后。7.E-cadherin低表达组5年生存率低于E-cadherin高表达组,差异具有统计学意义(p=0.042),提示E-cadherin表达缺失与疾病生存率降低有关。结论：1.在鼻咽癌组织中,TrkB表达增高,E-cadherin表达减低,两者可能参与了鼻咽癌的发生发展；2. TrkB可能作为淋巴结转移的重要预测因子；TrkB的过表达可能提示预后不良3. TrkB的表达水平与E-cadherin的表达水平在鼻咽癌组织中呈负相关性,提示TrkB过表达可能激活下游信号通路并下调E-cadherin的表达,影响肿瘤细胞的侵袭转移能力。第二部分鼻咽癌细胞中TrkB和E-cadherin蛋白表达及其与细胞侵袭转移能力的相关性目的：探讨体外培养的鼻咽癌细胞株TrkB蛋白和E-cadherin蛋白的表达水平之间的关系,并观察其表达水平的高低与不同鼻咽癌细胞亚株侵袭转移能力高低之间的联系,探索BDNF-TrkB信号通路是否能通过对E-cadherin的调控从而影响肿瘤的侵袭、转移。并筛选出TrkB高表达的鼻咽癌细胞亚株,为下一部分实验做准备。方法：Western blot实验分别检测永生化鼻咽上皮细胞NP69,鼻咽癌高转移细胞亚株5-8F与鼻咽癌低转移细胞亚株6-10B,还有喉癌细胞Hep-2中TrkB蛋白与E-cadherin蛋白的表达水平,划痕愈合实验和Transwell侵袭实验研究体外培养的鼻咽癌不同细胞亚株之间TrkB蛋白表达与运动迁移、侵袭转移能力的影响。结果：1. Western blot实验：1.1永生化鼻咽上皮NP69细胞并不表达TrkB蛋白,但强烈表达E-cadherin蛋白。TrkB蛋白在鼻咽癌5-8F细胞中的表达高于6-10B(p<0.05)。而在喉癌细胞株中也存在TrkB的过表达,且与鼻咽癌细胞株5-8F中TrkB蛋白的表达水平无显著性差异(p=0.289)。1.2E-cadherin在永生化鼻咽上皮NP69细胞中表达最高。鼻咽癌细胞株中,在6-10B细胞中的表达高于在5-8F细胞中(p<0.05)；在喉癌Hep-2细胞中,同样表达E-cadherin蛋白,但是其表达水平与E-cadherin在鼻咽癌5-8F细胞中的表达水平差异不大,没有统计学意义(p=0.734)。13鼻咽癌细胞中E-cadherin的灰度值与TrkB的灰度值相关系数为0.987,p=0.000(双侧),认为E-cadherin与TrkB呈直线相关。2.细胞划痕实验：永生化鼻咽上皮NP69细胞、鼻咽癌5-8F细胞以及鼻咽癌6-10B细胞划痕48小时后的迁移距离不同,永生化鼻咽上皮NP69细胞迁移距离极弱,鼻咽癌5-8F细胞明显多于其他组(p<0.01)。对三组细胞距离进行两两比较,发现NP69,5-8F与6-10B的差异均有明显的统计学意义(p<0.05)。结论：1.永生化鼻咽上皮细胞株NP69不表达TrkB蛋白,强烈表达E-cadherin;鼻咽癌细胞株中,5-8F表达TrkB蛋白的水平高于6-10B,而5-8F表达E-cadherin蛋白的水平低于6-10B。TrkB蛋白在喉癌细胞株中也存在过表达的情况,TrkB蛋白并非鼻咽癌的特异性指标；2.在鼻咽癌细胞株中,TrkB的表达水平与E-cadherin的表达水平呈负相关；同时鼻咽癌不同细胞亚株的侵袭转移能力与TrkB呈正相关,与E-cadherin的表达呈负相关；3.鼻咽癌细胞株侵袭转移能力可能与BDNF-TrkB信号通路有关。第三部分BDNF、K252a对鼻咽癌细胞侵袭转移能力的影响目的：前一部分实验已筛选出TrkB蛋白高表达的鼻咽癌细胞株5-8F。以此为基础,本部分实验研究将通过脑源性神经生长因子BDNF和酪氨酸激酶抑制剂K252a激活或抑制BDNF-TrkB信号通路,观察TrkB蛋白和E-cadherin蛋白表达水平的变化以及对体外培养的鼻咽癌5-8F细胞表型、运动迁移、侵袭转移能力的影响。方法：分别用不同浓度BDNF、K252a干预鼻咽癌5-8F细胞,MTT实验计算细胞生存(增殖)率,筛选BDNF、K252a干预浓度,分别用200ng/ml BDNF、00nM K252a干预鼻咽癌5-8F细胞,倒置显微镜下观察细胞表型改变,划痕愈合实验和Transwell侵袭实验观察细胞运动迁移能力、侵袭转移能力变化。Western blot检测鼻咽癌5-8F细胞TrkB、E-cadherin、vimentin等相关蛋白表达改变。RT-PCR检查鼻咽癌5-8F细胞TrkB、E-cadherin mRNA等相关mRNA表达改变。结果：1.MTT实验：BDNF对鼻咽癌5-8F细胞生长有促进作用,并与BDNF干预时间、浓度呈正相关。K252a能有效抑制鼻咽癌细胞株5-8F的生长,其抑制作用与K252a干预的时间、浓度呈正相关。2.倒置显微镜观察细胞表型改变：BDNF干预的鼻咽癌5-8F细胞后,细胞形态向长梭形、纺锤形改变,失去细胞间连接彼此间散,向间质细胞表型转变；K252a干预的细胞形态变圆或变方,细胞之间连接紧密并成团生长,细胞的上皮特征更明显；3.划痕愈合实验：24h200ng/ml BDNF干预组中细胞迁移距离为2.18±0.18mm;400nM K252a干预组中细胞迁移距离为0.54±0.07mm；对照组细胞迁移距离为0.98±0.18(p<0.05)。48h200ng/ml BDNF干预组中细胞迁移距离为2.99±0.11mm,400nM K252a干预组中细胞迁移距离为1.01±0.18mm；对照组细胞迁移距离为2.02±0.21(p<0.05)。4. Transwell侵袭实验：200ng/ml BDNF干预组到达下室的细胞数量为81.1±6.9个；400nM K252a干预组到达下室的细胞数量为13.6±3.4；对照组到达下室的细胞数量为53.1±6.6个。三组之间有明显差异,且具有统计学意义(P<0.05)。5. Western blot实验：用BDNF干预鼻咽癌5-8F细胞48h后,E-cadherin表达下调,TrkB表达上调不明显,Vimentin表达上调；K252a干预鼻咽癌5-8F细胞48h后,TrkB表达下调,E-cadherin表达上调,Vimentin表达下调。6. RT-PCR:在BDNF干预下,鼻咽癌5-8F细胞内的E-cadherin mRNA表达明显下调,TrkB mRNA表达稍上调；在K252a的干预下,E-cadherin mRNA的表达明显上调,而TrkB mRNA表达下调。结论：1. BDNF-TrkB信号通路激活使鼻咽癌5-8F细胞出现间质细胞表型,迁移、侵袭能力增强,并发现E-cadherin表达上调、vimentin表达下调。2.酪氨酸激酶抑制剂K252a能使鼻咽癌5-8F细胞的E-cadherin表达上调,vimentin表达下调,细胞运动迁移和侵袭转移能力减弱；3. BDNF-TrkB信号通路能通过抑制E-cadherin的表达抑制诱导EMT的发生。第四部分K252a对5-8F细胞裸鼠皮下移植瘤模型侵袭转移能力的影响目的：第三部分实验证明在体外环境中,BDNF-TrkB信号通路激活能通过抑制E-cadherin的表达诱导EMT的发生。TrkB酪氨酸激酶抑制剂K252a能使鼻咽癌5-8F细胞的E-cadherin表达上调,vimentin表达下调,细胞运动迁移和侵袭转移能力减弱。本部分实验我们将观察K252a干预后鼻咽癌5-8F细胞裸鼠皮下移植瘤模型的生长情况和TrkB蛋白和E-cadherin蛋白表达水平的变化。方法：首先构建鼻咽癌5-8F细胞裸鼠皮下移植瘤模型,并通过病理切片从组织学上证实建模成功。然后通过K252a干预后,观察移植瘤体的生长情况,比较组间差异。取新鲜瘤体标本进行Wastern blot实验,检测瘤体组织中TrkB、E-cadherin等相关蛋白表达改变。结果：1.裸鼠皮下成瘤实验：检测5-8F裸鼠皮下移植瘤实验组和对照组生长情况,并以公式volume=1/2*a*b2计算瘤体体积(a代表瘤体最长直径；b代表瘤体最短直径,单位mm)。结果显示：对照组瘤体体积764.3±537.2,实验组瘤体体积20.7±14.9,两组相比差异具有统计学意义(p=0.036)。2.Western blot实验：用BDNF干预鼻咽癌5-8F细胞48h后,E-cadherin表达下调,TrkB表达上调不明显,Vimentin表达上调；K252a干预鼻咽癌5-8F细胞48h后,TrkB表达下调,E-cadherin表达上调,Vimentin表达下调。结论：1.在鼻咽癌5-8F裸鼠皮下转移瘤模型中,TrkB酪氨酸激酶抑制剂K252a能有效抑制瘤体的生长；2. TrkB酪氨酸激酶抑制剂K252a能抑制鼻咽癌5-8F裸鼠皮下转移瘤的TrkB蛋白表达,使E-cadherin表达上调；3. TrkB酪氨酸激酶抑制剂K252a的衍生物可能能作为靶向治疗鼻咽癌的新药物。