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目 的近年来，由于受单基因疗效不足和载体转导效率低下的影响，肝癌免疫基因治疗研究受到限制，联合基因治疗成为目前肝癌生物治疗的发展趋势。大量研究表明，细胞因子IL-2和IL-12具有较好的抗瘤效应，两者通过激活自然杀伤细胞（NK）和细胞毒T淋巴细胞（CTL）发挥细胞免疫功能。为了解这两种细胞因子联合运用抗肝细胞癌效果，本研究采用质粒型真核双表达载体，通过瘤内注射“裸”DNA方法，对小鼠肝细胞癌H22皮下移植瘤动物模型进行随机对照研究。旨在探讨IL-12和IL-2双表达质粒载体组与各单细胞因子质粒载体组在基因表达、抑癌作用及增强免疫功能方面的差异，为今后进一步通过高效基因导入技术进行肝癌免疫基因治疗研究提供理论及实验依据。方 法1. 用分子克隆方法构建pDC511mIL12-hIL2、pDC511mIL12、pDC511hIL2真核表达质粒载体。2. 将各质粒载体用脂质体转染COS-7细胞，ELISA方法检测各组质粒DNA在真核细胞中表达情况。3. 淋巴母细胞增殖法（MTT法）检测mIL-12生物学活性；胸腺细胞增殖法（MTT法）检测hIL-2生物学活性。4. 小鼠肝癌H22皮下移植瘤瘤内直接注射质粒DNA 20μg后，ELISA法检测pDC511hIL2-mIL12，pDC511hIL2，pDC511mIL12，pDC511组在注射后0.5d，1d，2d，3d，5d，7d，10d，15d血清中hIL-2、mIL-12表达情况。5. 再次注射质粒DNA 20μg后，观察各组小鼠存活率、存活时间及肿瘤大小变化。6. 第二次质粒DNA注射后两周，乳酸脱氢酶（LDH）法检测各组小鼠脾脏细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性。7. 对各实验组在质粒DNA注射前及注射后一月、两月进行瘤体组织病理学观察。8. 统计方法：各式图表均用Excel软件处理。统计处理应用SAS软件：各处理组小鼠生存期用PL法进行生存分析，瘤体体积差异比较用重复测量多因素方差分析，各组小鼠存活率用Fisher精确检验。<WP=8>结 果1. 酶切鉴定各质粒载体，均示构建成功。2. 各质粒载体在真核细胞内能表达相应细胞因子（pDC511hIL2-mIL12组：hIL2为3087.18pg/（ml·24h·106）细胞；mIL12为674.56pg/（ml·24h·106）细胞。pDC511mIL12组mIL12为504.37pg/（ml·24h·106）细胞；pDC511hIL2组hIL2为4274.19pg/（ml·24h·106）细胞。空载体pDC511未检测到两种细胞因子表达。3. pDC511hIL2-mIL12质粒DNA转染COS-7细胞后收集的培养液上清与pDC511hIL2组和pDC511mIL12组相比，在相同稀释度下，更能刺激胸腺细胞或淋巴母细胞增殖。4. pDC511hIL2-mIL12组hIL2在瘤内注射后1-7天形成一表达峰，峰值为140.85±8.88pg/ml；mIL12表达峰持续时间为1-10天，峰值为75.52±17.19pg/ml 。pDC511hIL2组hIL2在2-7天形成一表达峰，峰值为98.34±6.94pg/ml 。pDC511mIL12组mIL12在2-10天形成一表达峰，峰值为49.38±3.63pg/ml 。pDC511hIL2-mIL12组在不同时间表达的hIL-2、mIL-12分别与pDC511hIL2 (p<0.01)、pDC511mIL12 (p=0.04)比较有显著性差异。pDC511hIL2-mIL12组mIL12、hIL2峰值分别与pDC511mIL12组、pDC511hIL2组比较有显著性差异（p<0.01）。5. 对四组质粒DNA注射后不同时间测得的瘤体体积进行比较，差别有显著性意义（p=0.03）。pDC511mIL12组和pDC511hIL2组无显著性差异（p>0.05），pDC511hIL2-mIL12组分别与pDC511mIL12 、pDC511hIL2组比较有显著性差异（p<0.05）。6. pDC511hIL2-mIL12，pDC511hIL-2，pDC511mIL-12，pDC511四组生存时间差别有非常显著性意义（p=0.001）。pDC511hIL2-mIL12组、pDC511hIL2组、pDC511mIL12组分别与空载体组比较有显著性差异，结果为：p=0.0002， p=0.03， p=0.03。pDC511mIL12组与pDC511hIL2组比较生存期无差异（p=0.69）；pDC511hIL2-mIL12组与单细胞因子质粒载体组生存期比较有显著性差异（p<0.05）。质粒DNA注射后三月，各组存活率比较无显著性差异（p=0.051）：pDC511hIL2-mIL12组71.43%(5/7)；pDC511mIL-12组42.86%(3/7)；pDC511hIL-2组28.57%(2/7)。 7. 在相同效：靶比情况下，pDC511hIL2-mIL12组与单表达质粒载体组和空载体组相比，小鼠脾CTL对肝癌细胞H22有较高杀伤率。单表达载体组在质粒DNA注射后一月，血管及肿瘤病灶周围有零星炎性细胞浸润，病灶内肿瘤细胞坏死明显，肿瘤细胞局限化。在质粒DNA注射后二月，<WP=9>8. 病灶内充满肿瘤细胞，仅见散在坏死灶及少量炎性细胞浸润。双表达载体组pDC511hIL2-mIL12在质粒注射后一月，病灶内大量炎性细胞浸润，坏死更明显，仅见散在少量肿瘤细胞。质粒DNA注射后二月，病灶内广泛炎性细胞浸润，仅见坏死而无肿瘤细胞。结 论1. 所构建各质粒载体能在真核细胞内高效表达相应细胞因子，表达的细胞因子均有生物学活性。与相应的单表达载体组相比，双表达载体组表达的mIL12和hIL2体外刺激淋巴母细胞和胸腺细胞增殖作用更明显。2. 瘤内注射双表达质粒DNA后，血清中经诱导产生的IL-2、IL-12比相应单表达载体组持续时间更长，峰值更高。3. IL-12和IL-2基因联合运用可明显增强CTL细胞毒活性，促进炎性细胞浸润，提高机体抗肿瘤免疫应答。4. IL-2、IL-12基因治疗可抑制小鼠肝癌H22皮下移植瘤生长，两者联