【染色体3p21鼻咽癌易感基因区LTF基因的筛查】在前期研究中，我室利用18个湖南鼻咽癌高发家系，通过连锁分析，首次发现染色体3p21部分区域与湖南家族性鼻咽癌发病紧密连锁，经单倍型分析和精细定位，将鼻咽癌易感基因区域定位于微卫星标记D3S1289-D3S1298之间。此结果提示：染色体3p21区域可能存在鼻咽癌的候选易感基因。为了进一步筛查与鉴定染色体3p21区域鼻咽癌的候选易感基因，本研究制备了两种不同的基因芯片，一种是基于鼻咽癌抑制消减杂交文库的cDNA mciroarray，另一种是包含染色体3p21区域(D3S1289-D3S1298)288个基因的专制芯片。为提高芯片筛查结果的可靠性，我们运用两种不同的基因芯片对相同的试验样本进行研究。首先，以4个鼻咽癌相关的抑制消减杂交文库(NNTDH12、TRP19 DHNE1、TNPC DNN119和TNN119 DNPC)为模板，利用PCR技术扩增点制cDNA芯片所需的克隆，每个文库约300个、总共1200余个克隆。克隆纯化后点制基于鼻咽癌抑制消减杂交文库的cDNA mciroarray。10例鼻咽慢性炎症组织和19例鼻咽癌组织标本以及3例鼻咽癌细胞样本与定制好的cDNA芯片杂交，基本数据利用Genepix Pro 3.0(Axon Instruments)来收集和基础处理。数据分析前，去掉芯片中的污点／坏点。为降低由于低表达基因点所造成的实验偏倚，只选择Cy5和Cy3信号值皆大于200的基因点，并对符合条件基因点的信号值进行均一化处理。经过上述处理后，共获得1097个有效克隆信号值。对上述已预处理的芯片杂交数据，挑取在所有样本中存在＞85％的信号值的克隆作进一步分析，898个(898／1097)克隆通过滤过。使用Euclidean distance and average linkage clustering方法，对每个样本和每个基因取平均值和均化处理，然后Hierarchical clustering聚类。聚类结果显示：898个克隆能够把鼻咽慢性炎症组织和鼻咽肿瘤组织很清晰的分为两大类，T01_F，T01_S作为两重复样本聚在一起，N8，N9和N10样本因均为鼻咽慢性炎症上皮，聚为一小束，再与其他正常鼻咽上皮聚类；三种鼻咽癌细胞系C1，C2和C3聚在一起，再与其他鼻咽癌组织样本聚为一大类。虽然898个克隆能够较好的区分鼻咽慢性炎症组织和鼻咽肿瘤组织，但是我们希望能够用最少的克隆数来达到最大的检验效能(即区分鼻咽慢性炎症组织和鼻咽肿瘤组织)。于是利用Genesis软件的ANOVA功能(选择p＜0.001为统计差异标准)对898个克隆进行了筛选，其中105个克隆满足要求。利用105个差异表达克隆进行Hierarchical clustering聚类。聚类结果表明：105个克隆仍然能够很好地把鼻咽慢性炎症组织和鼻咽肿瘤组织很清晰的分为两大类，T01_F，T01_S作为两重复样本聚在一起，N8，N9和N10样本因均为鼻咽慢性炎症上皮，先聚为一小类，再与其他正常鼻咽上皮聚类；三种鼻咽癌细胞系C1，C2和C3聚在一起，再与其他鼻咽癌组织样本进行聚类，说明该105个克隆能够达到898个克隆相同的检验效能。为进一步鉴定上述105个差异表达克隆，利用PCR方法扩增出相应的克隆片段，然后将PCR产物纯化后送生物技术公司测序，测序结果与NCBI数据库进行同源性比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。通过同源比对发现37个在鼻咽癌组织中高表达的克隆实际上代表STAT5A，RAB25、SPARC以及SPRR3等14个已知基因。各基因出现的频率存在差异，以STAT5A基因出现的频率最高(为7次，占18.92％)，其次是RAB25基因(出现5次，占13.51％)，紧追其后为SPARC和SPRR3基因。这14个基因分布在9条染色体上(包括1q、2q、4p、5q、7p、7q、12p、12q、13q、15q以及17q)。另外68个在鼻咽癌组织中低表达的克隆实际上代表LTF，PLUNC、CDC37L1以及HNRPDL等18个已知基因。各基因出现的频率存在差别，以PLUNC基因出现的频率最高(为21次，占30.88％)，其次是CDC37L1基因(出现9次，占13.24％)，紧追其后为HNRPDL基因。这18个基因分布在12条染色体上(包括1q、3p、4q、7q、8q、9p、11q、12p、12q、14q、16p、20q以及22q)。至此，利用基于鼻咽癌抑制消减杂交文库的cDNA microarray筛查到了包括染色体3p21鼻咽癌易感基因区LTF基因在内的32个鼻咽癌差异表达基因。此外，我们利用包含染色体3p21区域288个基因的专制芯片对上述相同的实验样本进行了研究，发现在3p21区域288个基因中，4个基因在鼻咽癌中表达下调，为乳铁传递蛋白LTF，dystroglycan 1，FLJ34969，和TU3A基因，而glutamate receptor，metabotropic 2，interleukin 17receptor B在鼻咽癌中存在表达上调。综合分析两组结果，发现LTF基因在两种基因芯片中得到相同的表达变化——在鼻咽癌组织中表达下调。两种不同的基因芯片、相同的研究样本，得到了相同的表达变化，有理由相信LTF基因在鼻咽癌发生、发展中起着重要的作用。为了验证芯片结果的可靠性，利用real-time quantitative RT-PCR技术，选择LTF、PLUNC、CDC37L1以及HNRPDL等4个在鼻咽癌组织中低表达的基因，另外选择在鼻咽癌组织中高表达的STAT5A、RAB25和SPARC基因进行验证。结果显示：LTF、PLUNC、CDC37L1和HNRPDL基因在鼻咽癌组织表达下调，STAT5A、RAB25和SPARC基因在鼻咽癌中表达上调。与芯片结果一致，说明芯片结果是可靠的。为了在大样本中进一步验证基因芯片筛查出来的差异表达基因，本研究利用组织芯片技术(TMA)与原位杂交技术结合验证LTF，PLUNC和STAT5A基因的表达情况。结果发现：LTF和PLUNC基因在鼻咽癌中的阳性表达率均明显低于癌旁上皮和鼻咽慢性炎症上皮(p＜0.01)，而STAT5A基因在鼻咽癌中的阳性表达率明显高于癌旁上皮和鼻咽慢性炎症上皮(p＜0.01)。此结果与芯片结果一致，进一步说明了芯片结果的可靠性。【LTF基因抑制鼻咽癌细胞增殖的功能研究】LTF(Lactotransferrin)基因能够在两种基因芯片中得到相同的表达变化，结合本室前期的家系连锁分析结果，有理由相信位于染色体3p21鼻咽癌易感基因区的LTF基因在鼻咽癌发病中起着重要作用。同时曾朝阳博士运用组织微阵列(TMA)和免疫组织化学技术对LTF基因蛋白水平的表达情况在较大样本中进行了研究，发现Lactotransferrin在鼻咽癌中表达下调，鼻咽癌癌旁和鼻咽慢性炎症组织中存在高表达。几乎所有的鼻咽部腺体均能检测到Lactotransferrin蛋白的存在，证实Lactotransferrin蛋白在腺体中高表达、为一细胞分泌性蛋白。此外，Lactotransferrin蛋白的表达与鼻咽癌转移呈负相关(p＜0.05)。Lactotransferrin蛋白的表达与鼻咽癌临床分期存在显著相关性(p＜0.01)。临床Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌中Lactotransferrin蛋白的表达明显高于临床Ⅲ和Ⅳ期(p＜0.01)。提示它可能与鼻咽癌的侵袭转移和临床进展有关，为鼻咽癌候选易感基因，可作为鼻咽癌侵袭、转移和临床进展预测的分子靶标。基因芯片和组织芯片结果均发现LTF基因在鼻咽癌中表达明显下调。为了明确LTF基因抑制鼻咽癌发生发展的可能作用机制，下一步拟探讨LTF基因对体外鼻咽癌细胞株的影响。首先利用重组人乳铁传递蛋白(Recombinant human lactoferrin，rhlf)对鼻咽癌细胞株CNE1、5-8F、HNE1以及6-10B进行干预，MTT试验检测LTF基因对体外鼻咽癌细胞株生长的影响。结果发现LTF基因能够明显抑制鼻咽癌细胞CNE1、5-8F以及HNE1的生长。CNE1、5-8F以及HNE1细胞用10μmol／L rhlf干预后生长速度明显减慢(与未干预组比较)，干预24或48小时后即出现统计学差异。此结果再次从体外细胞角度验证了本论文第一部分的基因芯片和组织芯片结果。表明LTF不仅在鼻咽癌组织中表达明显下调，而且能够延缓体外鼻咽癌细胞株生长、抑制肿瘤形成。然后，利用10μmol／L的rhlf对鼻咽癌细胞株ENE1、5-8F、HNE1以及6-10B进行干预，通过流式细胞术检测分析LTF基因对体外鼻咽癌细胞株细胞周期的影响。结果发现CNE1、5-8F以及HNEl细胞经10μmol／L的rhlf干预24或48小时后GO-G1期细胞百分比明显增多；S期和G2-M期细胞百分比则减少。但10μmol／L的rhlf干预对鼻咽癌6-10B细胞未产生明显影响。6-10B细胞是四种鼻咽癌细胞株中唯一一株没有转移潜能的，rhlf干预对其生长未产生明显的影响，这与前述基于组织微阵列(TMA)的免疫组织化学结果(LTF基因可能与鼻咽癌的侵袭转移和临床进展有关)互相印证，结果再次提示LTF主要作用于鼻咽癌发生发展的中晚期、在鼻咽癌转移过程中应该具有重要作用。此结果与MTT试验结果基本一致，证实LTF基因能够明显增加G0-G1期细胞比例、抑制体外鼻咽癌细胞的生长、增殖。为了探讨LTF基因延缓G0-G1期进程、抑制鼻咽癌细胞生长的可能机制，采用具有高转移特性的鼻咽癌5-8F细胞作为研究对象，应用rhlf对其进行干预，利用western blot技术检测Cyclin D1，p-Rb，p21，p27，p53，总stat3，p-star3(Tyr705)以及MAPK信号传导通路中JNK2，c-Jun，总ERK1／2，p-ERK1／2，c-fos等相关信号分子干预前后的表达情况，分析LTF基因抑制体外鼻咽癌细胞增殖的作用机制。鼻咽癌5-8F细胞用10μmol／L rhlf分别干预0min，5 min，10 min，30 min，60 min，12h，24h，36h，48h和72h后，抽提蛋白，western blot检测细胞周期蛋白cyclin D1、p-Rb的表达情况，结果发现：5-8F细胞用10μmol／L rhlf干预后周期蛋白cycl in D1、p-Rb的表达均低于对照组，说明LTF基因对周期蛋白cyclin D1、p-Rb的表达有重要影响。在此基础上，又检测了两种细胞周期素激酶(CDK)抑制蛋白p21，p27的表达情况。结果显示：鼻咽癌5-8F细胞用10μmol／L rhlf分别干预5 min，10 min，30 min，60 min，12h，24h，36h，48h和72h后，细胞周期素激酶(CDK)抑制蛋白p21，p27的表达与对照组相比(即0min)均增加。上述结果提示LTF基因通过调节周期蛋白cyclin D1、p-Rb以及细胞周期素激酶的表达来影响鼻咽癌5-8F细胞的增殖。为了进一步了解引起cyclin D1、p-Rb改变的相关分子事件，根据已有试验结果、结合文献资料，我们选择MAPK信号传导通路的信号分子用western blot方法对其表达情况进行检测。鼻咽癌5-8F细胞用10μmol／Lrhlf分别干预5 min，10 min，30 min，60 min，12h，24h，36h，48h和72h后，抽提蛋白，western blot检测JNK2，c-Jun，总ERK1／2，p-ERK1／2和c-fos的表达情况。结果显示：LTF对总ERK1／2的表达未见明显影响；但降低p-ERK1／2的表达，用10μmol／L rhlf干预60min后其表达量明显减少，随着干预时间的延长，其表达量有进一步减少的趋势：LTF对JNK2蛋白表达产生影响，用10μmol／L rhlf干预12h后JNK2的表达量明显减少；同时LTF降低c-Jun的表达，用10μmol／L rhlf干预30min后即出现明显减少，随后就维持在一个较为平稳的水平；此外LTF对c-fos的表达有着较大影响，用10μmol／L rhlf干预60min后其表达量明显减少，随着干预时间的延长，其表达量有进一步减少的趋势，这种变化与p-ERR1／2的表达变动情况相吻合。综上所述，LTF基因通过负性调控MAPK信号传导通路的JNK2和ERR亚家族，下调细胞周期蛋白cyclin D1，p-Rb以及细胞周期素激酶的表达，延缓鼻咽癌细胞G0-G1期进程，最终通过调节cyclins／CDKs／CKI／pRb为核心的G1／S期细胞周期网络调控系统来调控鼻咽癌5-8F细胞的生长、增殖。当然，基因表达调控系统是非常复杂和有机联系的，不同分子以及不同通路之间存在cross—talk，要明确LTF基因在其中所起的真正作用，还需以后进一步的实验证实。