狼疮性肾炎是系统性红斑狼疮最常见、最严重的并发症,是导致终末期肾脏病的重要病因之一,也是引起系统性红斑狼疮患者死亡的重要原因。狼疮性肾炎发病机制异常复杂,涉及到遗传背景、环境、内分泌异常及免疫功能紊乱等。调节性T细胞是一类具有免疫调节功能的T细胞亚群,参与包括狼疮性肾炎、肿瘤、类风湿性关节炎等在内的多种疾病的免疫调节,CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞是目前研究的比较多的调节性T细胞类型。它可以通过分泌抑制性细胞因子TGF-β和IL-10以及细胞-细胞接触等方式抑制树突状细胞对B细胞的抗原提呈能力,从而抑制辅助性T细胞活化B细胞,进而抑制B细胞生成各种自身抗体,从而减轻组织当中免疫复合物介导的各种损伤。众多的研究发现,在狼疮性肾炎疾病过程中,调节性T细胞的数量和/或功能下降,治疗后其数量增加和/或其功能改善可以对狼疮性肾炎产生保护性作用,延缓病情进展。目前治疗狼疮性肾炎的药物主要为激素以及免疫抑制剂等,但治疗效果并不十分理想。DYYG化合物是一种由北京德益阳光生物科技有限公司研发的新型小分子化合物,既往的实验发现DYYG化合物能够促进正常人外周血中CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞体外增殖,因此我们进一步采取体内、外实验,研究其对CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞增殖的影响,以及其对狼疮性肾炎的治疗作用和可能涉及到的作用机制。首先选用免疫磁珠法,分选8周龄雌性C57BL/6小鼠脾脏和淋巴结细胞中的CD4~+CD25~+T细胞进行体外细胞培养,应用不同浓度的DYYG化合物加以刺激,随后通过流式细胞术分析CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞增殖情况,采用ELISA法测定培养基上清中TGF-β1和IL-10的浓度。研究发现DYYG化合物可以促进C57BL/6小鼠脾脏和淋巴结细胞中的CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞体外增殖,DYYG化合物浓度为100n M时促进CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞增殖作用最强;该浓度时细胞培养基上清中TGF-β1和IL-10浓度明显升高,因实验过程中未加入TGF-β1和IL-10,故培养基上清中的TGF-β1和IL-10全部由CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞分泌;因此认为DYYG化合物可以促进CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞增殖并分泌TGF-β1和IL-10,改善了CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞部分功能,这可能是DYYG化合物通过刺激CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞增殖并发挥作用的机制之一。随后构建慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮性肾炎小鼠模型,研究DYYG化合物对狼疮性肾炎小鼠的治疗作用,是否可以刺激cGVHD狼疮性肾炎小鼠CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞数量增加,以及CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞是通过何种作用机制发挥其对狼疮性肾炎的治疗作用。研究证明DYYG化合物治疗可以有效的减轻狼疮性肾炎小鼠尿蛋白,减少血清抗双链DNA抗体的生成,减轻肾脏的病理损伤;通过流式细胞术分析小鼠外周血中的CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞变化,我们发现cGVHD狼疮性肾炎小鼠外周血中的CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞显著减少,而DYYG化合物治疗8周后,外周血中CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞数量明显增加,因此认为DYYG化合物对cGVHD狼疮性肾炎的治疗机制,某种程度上与其促进狼疮性肾炎小鼠的CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞的增加有关。随后测定小鼠外周血中TGF-β1和IL-10浓度,发现DYYG化合物治疗组TGF-β1和IL-10浓度明显升高,结合细胞实验结果,我们认为TGF-β1和IL-10浓度的升高可能与DYYG化合物刺激CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞增加有关。因此我们认为DYYG化合物可能通过促进调节性CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞数量增加、功能改善发挥其对cGVHD狼疮性肾炎小鼠的治疗作用。前期实验中,证实DYYG化合物可以促进正常人、C57BL/6小鼠以及cGVHD狼疮性肾炎小鼠的CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞增殖,因此我们行细胞实验进一步研究DYYG化合物能否可以影响狼疮性肾炎患者外周血CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞增殖。研究发现尽管DYYG化合物对狼疮性肾炎患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞体外增殖作用不明显,但免疫抑制实验提示DYYG化合物可以增强CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞功能。众多研究表明,体外实验中CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞大多可以通过细胞-细胞接触机制介导免疫调节,而CTLA-4通过与APC细胞表面的CD80/CD86结合,反式作用于APC细胞,导致T细胞的增殖减少,这是其细胞-细胞接触介导免疫调节的重要机制之一。因此我们加入CTLA-4抗体后重复免疫抑制实验,研究证实当加入CTLA-4抗体后,CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞免疫抑制能力下降。因此认为CTLA-4介导的细胞-细胞接触调节也可能是DYYG化合物通过刺激CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞发挥作用的方式。我们将进一步合成DYYG化合物,在小鼠体内分别中和TGF-β1、IL-10、CTLA-4后,进一步验证其治疗效果及作用机制。我们的研究也为狼疮性肾炎的新型治疗药物的研发打下了基础。综上我们得出结论:1.DYYG化合物可以促进C57BL/6小鼠CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞体外增殖;DYYG化合物可以促进CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞分泌TGF-β1及IL-10,改善与其相关的CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞功能。2.DYYG化合物对cGVHD狼疮性肾炎小鼠具有治疗作用;其作用机制可能与促进外周血中CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞增加有关,而CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞发挥其免疫调控作用与TGF-β1及IL-10的分泌有一定关系。3.DYYG化合物可以增强狼疮性肾炎患者外周血中CD4~+CD25~+FoxP3~+T细胞的免疫抑制功能,可能与体外CTLA-4介导的细胞-细胞接触机制发挥免疫调节作用有关。4.本研究也为新型治疗狼疮性肾炎的药物研发提供了理论支持。