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背景及目的:本课题组通过前期DNA芯片对鼻咽癌放疗抵抗型病人和放疗敏感型病人组织进行基因表达谱比较,其中差异倍数最大的是集落刺激因子-1受体(Colony stimulaiting factor 1 receptor,CSF-1R),它在放疗抵抗型病人组织中上调表达,在放疗敏感型病人组织中下调表达,其可能是放疗抵抗的一个关键分子,但CSF-1R在鼻咽癌放疗抵抗中的机制尚不明确。本课题组在对临床标本实验的探究以及免疫组织化学方法分析CSF-1R在鼻咽癌和鼻咽炎中的差异表达的基础上,利用实时荧光定量PCR(Real-Time Quantitative Polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western Blot从鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B和CNE-2中筛选出CSF-1R高表达(CSF-1R+)细胞株5-8F和CSF-1R低表达(CSF-1R-)细胞株6-10B。进一步进行体外实验从细胞实验层面探讨鼻咽癌CSF-1R+细胞株和CSF-1R-细胞株之间以及在接受X线照射前后增殖能力和凋亡情况的变化。以期寻找鼻咽癌患者的治疗新靶点,同时能为鼻咽癌的治疗及预后找到一个新的预测指标。研究方法:1.采用6-MV X线直线加速器按0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy的剂量分为5组,分别照射CSF-1R+细胞株5-8F和CSF-1R-细胞株6-10B,照射后分别继续培养各组细胞。2.采用CCK-8法来检测CSF-1R+细胞株5-8F和CSF-1R-细胞株6-10B的增殖能力,以及检测接受不同剂量照射前后的5-8F细胞株和6-10B细胞株的增殖能力之间的差异。3.采用克隆形成实验检测CSF-1R+细胞株5-8F和CSF-1R-细胞株6-10B的增殖能力,以及检测接受不同照射剂量前后的5-8F细胞株和6-10B细胞株的增殖能力的差异。4.采用流式细胞术检测CSF-1R+细胞株5-8F和CSF-1R-细胞株6-10B的凋亡情况,以及检测接受不同照射剂量前后的5-8F细胞株和6-10B细胞株的凋亡之间的差异。5.采用RT-PCR检测CSF-1R+细胞株5-8F和CSF-1R-细胞株6-10B,以及检测接受不同照射剂量前后的5-8F细胞株和6-10B细胞株的P53,Fas L的表达水平。6.通过RNA过表达技术构建6-10B细胞株CSF-1R过表达慢病毒载体。结果:1.体外实验分别检测5-8F细胞株(CSF-1R+)和6-10B细胞株(CSF-1R-)细胞增殖、凋亡能力的差异:1.1 CCK-8增殖实验表明细胞株5-8F增殖能力高于细胞株6-10B(P<0.05)1.2克隆形成实验表明细胞株5-8F增殖能力高于细胞株6-10B(P<0.05)1.3流式细胞术检测凋亡情况,表明两种细胞的凋亡是有差异的,5-8F细胞的凋亡高于6-10B细胞,差异明显。2.体外实验检测接受X线照射后5-8F细胞株(CSF-1R+)和6-10B细胞株(CSF-1R-)(收集不同剂量点和不同时间点的细胞)增殖、凋亡能力的变化:2.1 CCK-8实验表明:和阴性对照组比较,在培养36小时后,2Gy、4Gy、6Gy剂量照射后的5-8F细胞增殖情况存在显著差异(F=1.639,P<0.01),6-10B细胞株2Gy、4Gy、6Gy剂量照射后增殖情况存在差异,但差异比5-8F小(F=0.928,P<0.05)。和阴性对照组比较,在培养48小时后,2Gy、4Gy、6Gy剂量照射后的5-8F细胞增殖情况存在显著差异(F=1.548,P<0.01),6-10B细胞株2Gy、4Gy、6Gy剂量照射后增殖情况存在明显差异,(F=9.622,P<0.01)。2.2克隆形成实验结果表明:各组均有细胞集落形成,但数目和大小均存在差异,实验结果显示细胞株5-8F的克隆计数要比细胞株6-10B的克隆计数要高(P<0.05)。集落的数目和X线照射的剂量成反比。2.3流式细胞术实验结果表明:5-8F细胞株凋亡高于6-10B细胞株。3.采用RT-PCR从基因水平检测CSF-1R+细胞株5-8F和CSF-1R-细胞株6-10B增殖和凋亡相关因子的表达情况:3.1增殖相关因子P53在CSF-1R+细胞株5-8F和CSF-1R-细胞株6-10B中的表达未见明显差异(P>0.05);3.2凋亡相关因子Fas L在5-8F细胞株(CSF-1R+)和6-10B细胞株(CSF-1R-)中的表达并未见明显差异(P>0.05);3.3在细胞接受2Gy X射线照射后,增殖相关因子P53的m RNA表达水平变化差异无统计学意义(P>0.05),但细胞株5-8F细胞P53表达增高大于6-10B细胞株;3.4细胞株5-8F接受X线照射2Gy和未接受X线照射的Fas L的m RNA的表达水平之间存在差异,且有统计学意义(P<0.05);细胞株6-10B接受X线照射2Gy和未接受X线照射中Fas L的m RNA的表达水平之间的差异无统计学意义(P>0.05);接受2Gy照射的5-8F细胞株中Fas L的m RNA的表达水平低于和6-10B细胞株,差异有统计学意义(P<0.05)。这表明,接受2Gy照射后5-8F的Fas L表达水平的降低高于6-10B,CSF-1R的表达和细胞的放射抵抗性是呈正相关的。4.成功构建CSF-1R过表达的慢病毒载体。用于下一步研究CSF-1R阴性细胞株转染CSF-1R过表达慢病毒载体后细胞功能的变化。结论:1.不同鼻咽癌细胞株的增殖和凋亡能力存在差异。2.不同鼻咽癌细胞株在接受X线照射前后的增殖和凋亡能力存在差异,且CSF-1R+细胞株和CSF-1R-细胞株照射前后的增殖和凋亡能力变化水平也存在差异。3.CSF-1R的表达和鼻咽癌细胞株的放射抵抗有一定相关性,其机制复杂,具体原因尚待进一步研究4.成功构建CSF-1R过表达慢病毒载体,用于下一步研究CSF-1R-细胞株转染CSF-1R过表达慢病毒载体后细胞功能的变化。