雄激素/雄激素受体信号轴作为一普遍存在于人体细胞内的信号通路,除起到促进男性发育与性征维持的关键作用外,也参与了细胞代谢与免疫调节等生理过程。此外,越来越多的研究证实,其还对细胞的增殖,凋亡等生命活动过程起到了广泛的调控作用。但同时,也因其具有上述广泛高效的调控作用,雄激素信号轴在肿瘤发生发展中所扮演的角色长期以来被众多研究所关注。前期,在肿瘤研究中,因雄激素信号轴本身作为与男性生理调节密切相关的信号通路,一直以来大量的研究主要集中于男性生殖系统肿瘤例如前列腺癌中。但随着研究的深入,越来越多与激素相关的肿瘤被发现与其存在密切联系。这其中,卵巢癌作为女性生殖系统恶性肿瘤,之前的研究较少将其与雄激素关联,但作为重要的性激素合成与分泌器官,其组织中除存在大量的雌孕激素外,还存在高水平的雄激素,而近年来,雄激素/雄激素受体轴与卵巢癌发生发展间的关联被不断认识与探索。而另一比较特殊的肿瘤——肝癌,其发生率存在明显的性别偏倚,即全世界范围内,在排除环境及生活习惯等外在因素影响的情况下,男性的发病率也明显高于女性。虽然肝脏作为人体重要的代谢器官并不直接参与性激素的合成,但其是性激素代谢的重要场所,其微环境中雄激素水平也较一般非性腺组织高。目前,卵巢癌患者5年生存率仅为40%,死亡率高居妇科肿瘤之首,其不良预后与卵巢癌细胞的耐药、复发密切相关,但该过程中的具体原因尚不完全清楚;与此同时,肝癌作为恶性程度较高的肿瘤,其5年生存率在所有肿瘤中也处于较低水平。因此对卵巢癌和肝癌发生发展的相关影响因素及机制的研究有着重要的理论与应用价值。而两者与雄激素之间的关联,使得我们对雄激素/雄激素受体轴在卵巢癌及肝癌等性激素相关性肿瘤的发生发展中的共性作用产生兴趣。近年来,随着对肿瘤生物学行为和特征的不断认识,众多研究证实,肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)在肿瘤各阶段的进程中扮演了十分关键的角色,其通过不断的自我更新及有效地抵抗外来损害等机制,成为肿瘤发生、耐药及复发等环节的关键因素。而肿瘤干细胞存在一个动态演变的过程,在肿瘤生长的同时,其内的干细胞也面临分化的压力;同时,一部分非肿瘤干细胞在各种因素影响下又可以逆分化为具有肿瘤干细胞样特征的细胞。因此,调控肿瘤细胞干性的相关因素及机制成为目前抗肿瘤研究的重点之一。介于雄激素信号轴与卵巢癌及肝癌等激素相关性肿瘤间的关联,以及肿瘤干细胞在肿瘤发生发展中的重要地位,我们对雄激素/雄激素信号轴是否参与恶性肿瘤细胞的干性调控产生了兴趣。本课题组前期研究证实干性基因nanog可以作为肿瘤干细胞标记,并在肿瘤细胞的干性调控中发挥了重要的调控作用;而另一方面,根据相关文献报道雄激素受体能够促进nanog基因的表达。所以,结合相关实验及理论基础,本课题中,我们对雄激素/雄激素受体信号轴对肿瘤细胞干性的影响,及其作用背后的相关机制等问题进行了探讨与研究。本文主要的研究方法及结论如下:1.证实在卵巢癌及肝癌组织中雄激素受体(androgenreceptor,ar)存在异常高表达,且其表达与肿瘤干性标记nanog间存在关联(1).证实了ar在卵巢癌及肝癌组织较对应的正常组织明显高表达。通过对卵巢癌及肝癌临床组织标本进行免疫组织化学染色和westernblot检测证实:ar在卵巢癌及肝癌组织中表达较对应的正常组织明显增高。(2).ar与nanog表达在肿瘤组织中存在相关性。通过westernblot,我们进而检测了nanog的表达量,其在肿瘤组织中也较正常组织高表达。通过皮尔森相关性分析证实,ar与nanog在肿瘤组织中的表达存在相关性。2.通过crispr/cas9系统构建内源性nanog基因标记细胞模型,证实ar与nanog在细胞中表达趋势一致且存在共定位。(1).通过crispr/cas9系统构建内源性naong基因标记细胞模型。首先,进行grna设计和利用bbsi酶切构建了nanog基因crispr/cas9+grna打靶载体;同时,采用pcr,限制性核酸内切酶酶切及gibson克隆等方法构建了nanog-2a-gfp重组同源臂质粒。通过对卵巢癌及肝癌细胞系分别同时转染上述两种质粒,我们利用细胞自身的同源重组修复机制将gfp绿色荧光蛋白编码基因重组入了nanog编码区的后方,并通过流式细胞分选gfp阳性单克隆细胞进行单克隆细胞培养,进而进行pcr,酶切及测序鉴定,筛选了打靶正确的gfp标记nanog单克隆细胞株。(2).检测nanog基因打靶细胞不同细胞亚型生物学功能差异。首先,通过流式细胞分选同株细胞中gfp(+)及(-)细胞,并经过rt-pcr及westernblot检测证实,在gfp(+)细胞中,nanog基因表达在mrna及蛋白水平都明显高于gfp(-)细胞;其次,通过体外细胞成球及克隆形成实验证实gfp(+)细胞成球及克隆形成等干性指标较gfp(-)明显增高;最后通过小鼠体内成瘤实验进一步证实gfp(+)细胞的肿瘤形成能力明显高于gfp(-)细胞。(3).在单克隆细胞株中证实ar与nanog表达存在一致性,且两者在细胞中存在共定位。通过rt-pcr及westernblot检测证实了ar与nanog在细胞中的表达在转录及蛋白水平都具有一致性,且都在gfp(+)细胞表达高于gfp(-)细胞;进而通过激光共聚焦对两者进行免疫荧光的共定位检测,证实两者在gfp(+)细胞中存在共定位而在gfp(-)中无表达。3.揭示雄激素信号轴通过促进nanog基因表达对肿瘤细胞干性产生的调控作用及机制。(1).证实雄激素信号轴能够调控nanog基因表达。利用双氢睾酮(dht)刺激或者雄激素受体促降解剂(asc-j9)抑制雄激素信号轴的活性,通过rt-pcr及westernblot检测ar及nanog基因在mrna及蛋白水平的表达变化情况证实,在dht刺激后细胞的ar与nanog基因mrna及蛋白表达都明显增高,而dht的该作用能够被asc-j9抑制。(2).证实雄激素信号轴能够调控肿瘤细胞干性。通过dht和(或)asc-j9对gfp(+)及(-)细胞进行处理,证实激活雄激素处理能够明显增强细胞的克隆形成及成球能力,而抑制该信号轴能够逆转该作用。(3).证实雄激素信号轴对于肿瘤细胞干性的调控是通过nanog介导的。通过慢病毒载体对单克隆细胞株进行nanog基因过表达及敲低,建立nanog过表达及敲低细胞系,进而分别对nanog敲低细胞株中进行dht处理和对nanog过表达细胞进行asc-j9处理,检测两者的成球和克隆形成等干性指标,结果显示dht不能增强nanog敲低细胞株的干性,而asc-j9对于nanog过表达的细胞干性下调作用也不明显。(5).证实ar能够直接结合nanog启动子区,激活其启动子活性进而上调其表达。首先,我们通过序列片段分析证实nanog启动子上存在ar特异性结合序列,并通过染色质免疫共沉淀(chip)证实ar与nanog启动子相应区域的特异性结合能力。其次,通过构建nanog启动子区不同区域的荧光素酶报告基因慢病毒载体,并感染相应细胞系,获得了具有nanog启动子活性报告系统的细胞株;进而对细胞进行dht和(或)asc-j9处理后检测其荧光素酶活性,证实ar与nanog启动子区的结合能够激活其转录活性。4.动物体内实验验证雄激素/雄激素受体信号轴的促瘤作用(1)构建去势裸鼠模型。通过摘除裸鼠双侧睾丸构建去势小鼠模型,进而将该去势小鼠分为去势组和去势补充雄激素治疗组。(2).分组建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察统计未处理组,去势组及去势补充雄激素治疗组后肿瘤生长及体积,证实去势组肿瘤体积较其他两组明显减小。(3).证实雄激素在体内能够促进Nanog表达,且AR与Nanog在组织中存在共定位。通过移植瘤连续切片免疫组化检测证实未处理组及补充雄激素组切片中Nanog及AR明显高表达,且两者存在组织细胞共定位。综上,本研究的结论主要可归纳为:1.AR在卵巢癌及肝癌组织及细胞中异常高表达,且与干性基因Nanog的表达存在一致趋势,两者表达也存在正相关关系。2.雄激素信号轴能够通过AR直接绑定Nanog启动子激活其转录活性,上调Nanog基因的表达,进而对肿瘤细胞干性起到促进作用,且Nanog是该干性调控作用中的关键分子。3.雄激素信号轴能够促进肿瘤细胞的体内成瘤及生长。综上,本研究通过探讨雄激素信号轴与卵巢癌及肝癌两种激素关联性较高的肿瘤间的作用,证实了雄激素信号轴能够对肿瘤细胞干性起到促进作用,并通过研究该调控的相关机制,证实干性基因Nanog参与这一过程。本研究一方面丰富了雄激素信号轴与肿瘤发生发展间的认识,从肿瘤干细胞层面阐述了相关机制;另一方面也为卵巢癌和肝癌这类与性激素相关的肿瘤的治疗提供了新的策略和靶点。