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目的:富集于伪足的非典型激酶1(pesudopodium-enriched atypical kinase 1,PEAK1)是一种具有催化活性的非受体型酪氨酸激酶,其广泛表达于多种组织与器官。本课题拟研究PEAK1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况,探讨其在NSCLC发生发展中的生物学作用,初步探索其可能参与的信号通路,从而为其是否能成为肺癌治疗靶点提供理论依据。方法:一、分析NSCLC组织中PEAK1表达水平和临床病理参数之间的相关性获取东南大学附属中大医院心胸外科经手术切除的102例肺癌组织标本(68例石蜡包埋肺癌组织和34例石蜡包埋癌旁正常组织),免疫组织化学染色分析NSCLC组织和癌旁正常组织中PEAK1表达情况,统计分析PEAK1表达情况与临床病理参数之间的关系。二、探讨PEAK1在NSCLC细胞中增殖、迁移和侵袭中的作用1.用qRT-PCR和Western blot测定五种肺癌细胞株中PEAK1表达水平,选择95D及H1299细胞株进行后期实验。2.用慢病毒载体感染95D细胞和H1299细胞,构建PEAK1过表达及敲除的95D和H1299细胞株,以及相应的空载对照组细胞株;然后用Western blot验证各感染组PEAK1表达情况。3.用CCK-8试剂盒检测各感染组细胞增殖活力;用划痕实验检测各感染组细胞迁移能力;通过Transwell侵袭实验检测各感染组细胞侵袭能力;体内实验检测NSCLC细胞过表达PEAK1和敲除PEAK1后对腹腔转移能力的影响。三、初步探讨PEAK1在NSCLC细胞迁移、侵袭和转移中的关键信号通路观察PEAK1过表达和敲除后,95D细胞和H1299细胞形态学上发生的变化;使用Western blot技术和细胞免疫荧光技术测定各实验组和对照组中E-cadherin和N-cadherin表达水平;测定各实验组和对照组中MMP2和MMP9蛋白表达水平;测定细胞形态发生变化的关键作用基因;初步筛选PEAK1参与调控的信号通路,并研究其是否调控NSCLC发生迁移、侵袭、转移以及EMT现象;使用小分子抑制剂抑制关键信号通路分子,进一步验证PEAK1调控NSCLC发生迁移、侵袭、转移以及EMT现象的机制。结果:1.免疫组织化学结果发现,PEAK1在NSCLC组织中的表达显著高于癌旁正常组织(P<0.01),PEAK1高表达并不与年龄、肿瘤大小、组织学类型、分化程度和TNM分期相关(P>0.05),而与淋巴结转移和性别相关(P<0.05)。2.过表达PEAK1明显促进95D细胞和H1299细胞迁移、侵袭和转移能力(P<0.05),敲除PEAK1显著抑制95D细胞和H1299细胞迁移、侵袭和转移能力(P<0.05)。体内腹腔转移模型实验发现,PEAK1过表达组相比于对照组肿瘤转移性结节数目明显增多(P<0.05);敲除PEAK1后,则呈现相反的实验结果。3.过表达PEAK1后,95D细胞和H1299细胞从上皮样表型变成间质样表型,同时伴有E-cadherin表达水平明显下降(P<0.05),N-cadherin表达水平明显增加(P<0.05);基质金属蛋白酶MMP2和MMP9表达水平明显上调(P<0.05);体内实验也发现,过表达PEAK1组相比于对照组,转移性结节肿瘤中N-cadherin、MMP2和MMP9表达水平明显上调(P<0.05),E-cadherin表达水平明显降低(P<0.05)。除此之外,过表达PEAK1后,95D细胞中EMT相关转录因子Zeb2表达上调;H1299细胞过表达PEAK1后EMT相关转录因子Twist2表达上调(P<0.05)。以上结果提示PEAK1促进NSCLC细胞发生了上皮间充质转化(EMT)。敲除PEAK1基因后,95D细胞和H1299细胞从上皮样表型变成更加紧密的上皮样表型,同时伴有E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05),N-cadherin表达水平显著降低(P<0.05);MMP2和MMP9表达水平明显下调(P<0.05);敲除PEAK1后,95D细胞中Zeb2表达下调,H1299细胞中则Twist2表达下调(P<0.05)。以上PEAK1敲除实验结果与过表达实验结果相对应,因而说明PEAK1确实能促进NSCLC细胞发生EMT。同时,过表达PEAK1后,95D细胞和H1299细胞中phospho-ERK1/2和phospho-JAK2表达水平都明显上调(P<0.05);敲除PEAK1后,则两者表达都明显下调(P<0.05);使用ERKl/2信号抑制剂PD98059和/或JAK2抑制剂AZD1480后,过表达PEAK1的95D细胞中N-cadherin、MMP2与MMP9表达水平明显下降(P<0.05),E-cadherin表达明显上调(P<0.05),细胞迁移和侵袭能力明显减弱(P<0.05);这说明JAK2和ERK1/2信号通路能调控PEAK1促进NSCLC细胞迁移、侵袭和转移并发生EMT。结论:PEAK1在NSCLC组织中高表达,并与淋巴结转移和性别差异相关;PEAK1虽然不能促进NSCLC的增殖活性,但体内外实验均表明,PEAK1能增强NSCLC细胞的迁移、侵袭和转移能力;究其机制发现,在不同的NSCLC细胞中,PEAK1可能通过JAK2和ERK1/2信号通路调控不同的EMT核转录因子,从而使得NSCLC发生EMT继而增强NSCLC的迁移、侵袭和转移能力。