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目的: 本研究基于类风湿关节炎临床表现、细胞因子、激素水平以及生物钟基因的昼夜节律性等研究基础,以中医针灸理论为指导,选择卯时和酉时介入艾灸治疗,采用ELISA、RT-PCR等技术方法,观察不同时辰艾灸治疗实验性RA大鼠的抗炎节律效应及生物钟基因表达水平和节律的影响,探索艾灸对RA病理节律的调控机制,进一步丰富艾灸治疗RA的科学内涵. 方法: 本实验将96只Sprague-Dawley( SD)成年大鼠随机分为空白组、模型组、卯时艾灸组、酉时艾灸组,每组24只动物,雌雄各半.各组又按4个取材时间点分为4个时间亚组(0:00组,6:00组,12:00组,18:00组),每组6只大鼠.各组大鼠全程授予Light-Dark (L∶D) 12∶12的光暗限制.除空白组外,各组大鼠于右后足垫部皮下注射弗氏完全佐剂0.15ml塑造RA模型.卯时组、酉时组大鼠分别在对应的时辰(卯时组5-7AM,酉时组5-7PM)接受单侧肾俞、足三里穴麦粒灸治疗(双侧交替),每日一次,6次为一疗程,共治疗3个疗程,各疗程之间休息一天.分别于造模前、造模后、每疗程治疗后测量各组大鼠体重及足容积,并计算足肿胀度;治疗结束后分别在各组相应时间点采集检测样本,采用酶联法( ELISA)检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α以及CORT的循环浓度,实时荧光定量法( RT-PCR)检测下丘脑、海马、肾上腺的核心生物钟基因CLOCK、BMAL1、PER2、REV-ERBα的mRNA相对表达定量.采用SPSS21.0统计软件包以及Halberg余弦法统计分析实验数据. 结果: 1通过对各组整体计量资料数据的比较分析,结果显示: (1)与空白组相比,模型组大鼠足肿胀度、血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高(P<0.05),血清CORT含量显著下降(P<0.05),表明造模成功;模型组大鼠海马和肾上腺中CLOCK、PER2mRNA表达水平显著下降(P<0.05),提示实验性RA大鼠核心生物钟基因的表达水平受到了一定程度的影响. (2)与模型组相比,艾灸治疗组大鼠足肿胀度、血清IL-6、TNF-α含量明显降低(P<0.05),表明艾灸可降低炎性细胞因子血清含量、缓解关节肿胀;卯时组大鼠海马CLOCK和PER2mRNA表达显著上调(P<0.05),表明艾灸可能具有良性调控生物钟基因表达水平的作用. (3)与卯时组相比,酉时组大鼠IL-1β、TNF-α血清含量呈明显的下降趋势,但差异无统计学意义. (4)不同时间点的时间序列方差分析显示艾灸对IL-1β、IL-6、TNF-α抑制作用在子时最为显著,表明艾灸对抗RA炎症具有节律性. 2通过对昼夜节律参数的比较分析,结果显示: (1)与空白组相比,模型组大鼠海马和肾上腺REV-ERBamRNA昼夜节律消失;血清IL-1β、IL-6、TNF-α以及下丘脑REV-ERBamRNA昼夜节律紊乱,中值均显著升高(P<0.01),振幅不同程度升高,峰相位明显后移;CORT昼夜节律紊乱,中值明显降低(P<0.01),振幅降低,峰相位后置.提示实验性RA大鼠生物钟核受体、细胞因子和激素水平紊乱甚至消失的昼夜节律是RA的病理节律基础. (2)与模型组相比,治疗组IL-1β、TNF-α中值和振幅均有所降低,峰相位前移;IL-6中值显著下降(P<0.05),振幅明显降低,峰相位变化差异不显著;CORT中值明显升高(P<0.05),振幅升高,峰相位前移:下丘脑REV-ERBamRNA振幅降低,峰相位显著前移;肾上腺、海马REV-ERBamRNA昼夜节律都已恢复,振幅呈上升趋势,峰相位后移.表明艾灸可恢复实验性RA大鼠REV-ERBamRNA消失的昼夜节律,还可促进细胞因子、激素、生物钟核受体昼夜节律再同步. (3)与卯时组相比,酉时组IL-1β、CORT、以及下丘脑、海马中REV-ERBamRNA的峰相位均不同程度前移并与正常组更为接近. 结论: 1.艾灸具有明确的抗炎效应:艾灸可显著降低实验性RA大鼠炎性细胞因子IL-6和TNF-α的血清含量从而对抗RA炎性反应,明显缓解RA关节肿胀. 2.艾灸可良性调整RA病理节律:REV-ERBa、炎性细胞因子、激素水平的昼夜节律紊乱是RA病理节律的基础,而REV-ERBamRNA昼夜节律消失是体液因子节律紊乱的重要原因;艾灸可良性整复REV-ERBamRNA的昼夜节律从而促进IL-1β、IL-6、TNF-α、CORT的节律再同步. 3.艾灸节律性对抗RA炎性反应:艾灸可通过调控生物钟基因的表达节律来整复紊乱的生物钟系统,从而促进RA炎性因子和激素水平的昼夜节律再同步,进而发挥其精准的节律性抗炎效应,达到良性调节RA病理节律的目的.