背景：　　在原发性肝癌中，肝细胞癌是主要的组织学亚型，占世界范围内总肝癌的70-85％，是发病率排第六位，致死率排第三位的癌症。在过去30年，对肝细胞癌的治疗尽管有明显改善，仍缺乏有效的预防措施，只有序贯疗法被临床认可用于早期肝细胞癌病人;然而，这种疗法的预后不佳，这主要归因于肝内转移极易复发。肝细胞癌治疗仍是一个医学难题，尤其是对于没有显著血管入侵，局部淋巴结或远端转移的早期肝细胞癌病人。　　许多研究表明肝脏是脂类、脂蛋白类和载脂蛋白类代谢的关键器官，并且人类很多载脂蛋白是由肝脏产生。有研究表明，肝细胞癌病人血浆脂质成分异常。在肝细胞损伤和肝细胞癌迁移、侵袭、增殖等过程中，血浆脂质和脂蛋白发生改变。在慢性肝脏疾病和肝细胞癌中，血清脂类、脂蛋白类和/或载脂蛋白类水平可反映出肝细胞损伤程度。ApoM是近期发现的一种载脂蛋白，它主要与人类血浆中高密度脂蛋白相关联，也有少量出现在甘油三酯和低密度脂蛋白中。apoM主要表达在肝细胞和肾小管细胞中，也有一定程度表达于胎儿肝脏和肾脏。Jiang等人发现apoM在肝细胞癌病人血浆表达水平较正常受试者显著升高，但在肝细胞癌组织中的apoM的mRNA和蛋白质显著低于它们的癌旁组织。尽管进行了大量研究，apoM和肝细胞癌进展关系仍未阐明;肝细胞癌的潜在发病机制是否与apoM直接相关仍不清楚。在本研究中，我们发现apoM有显著的抗癌特性，可能通过抑制肝癌细胞的侵袭、迁移、增殖，并且可以通过抑制Bcl2A1表达从而促进肝癌细胞凋亡。此外，hsa-miR-573下调apoM表达，诱导Bcl2A1表达，减少癌细胞凋亡，促进裸鼠体内移植肿瘤的生长。　　目的：　　1、观察apoM是否可以影响HepG2细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡。2、观察Hsa-miR-573是否可以影响apoM表达。3、观察Hsa-miR-573是否可以影响HepG2细胞侵袭、迁移、增殖及细胞凋亡。4、观察Hsa-miR-573通过apoM是否可以影响HepG2细胞凋亡及相关机制研究。5、观察Hsa-miR-573和apoM是否可以影响其它肝癌细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡。6、通过裸鼠成瘤实验，观察hsa-miR-573和apoM是否可以影响肿瘤生长。7、在肝细胞癌病人中，血清apoM表达与其它诊断肝癌生化指标是否相关。　　方法：　　1、观察apoM对HepG2细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡的影响。　　1.1人类HepG2细胞从American Type Culture Collection(ATCC，ManaSsas，VA，USA)获得，用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养，DMEM培养基包含10％胎牛血清、链霉素(100μg/mL)及青霉素(100 U/m1)。为了长期培养，每月对所有细胞株测试是否感染支原体。全部细胞在37℃，5％二氧化碳环境下孵育。细胞被种植于6孔板或12孔板或60毫米平皿，并且生长到铺满平皿达80-90％时待用。　　1.2人类HepG2细胞在含25 cm2腔室细颈瓶中在标准培养条件(5％ CO2，37℃)培养，其中含有DMEM培养基，伴有10％胎牛血清。慢病毒空载体标记绿色荧光蛋白(GFP; LV-Mock)和过表达人类apoM慢病毒载体(LV-apoM)标记GFP。在8 mg/mL聚凝胺条件下，细胞被慢病毒载体转染。孵育24小时后用新鲜的通用培养基清洗细胞。转导96小时后计数GFP阳性细胞。　　2、观察Hsa-miR-573对apoM表达的影响。　　根据试剂说明书用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取肝脏组织或培养细胞总RNA。根据试剂说明书用miRVana PARIS试剂盒(Ambion，Austin，TX，USA)从200μL血清中分离总RNA。启用靶点预测算法如miRBase、PicTar、TargetScan和RNAhybrid，推测出apoM调节器有hsa-miR-145-5p、hsa-miR-145-3p、 hsa-miR-221-5p、hsa-miR-221-3p，、 hsa-miR-222-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-766-5p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573。根据说明书在20微升反应孔用All-in-OneTM miRNA qPCR试剂盒检测推测出的九种小RNA(miRNAs)调节器。采用实时PCR ABI7500 Fast系统(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行实时PCR。以U6 RNA作为内参。为了分析血清hsa-miR-573，合成的spiked-in Caenorhabditis elegans miR-39提取之前加入血清标本作为内参RNA。采用ABI7500快速实时PCR系统SYBR Green检测试剂(TaKaRa Bio，Inc.，Shiga，Japan)通过实时定量PCR测定信使RNA水平。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参。采用AACt方法定量测量。所有标本测量三次，并且取平均值进行比较分析。　　结果：　　1.观察apoM对HepG2细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡的研究。　　Jiang等人证明肝细胞癌组织中apoM mRNA和蛋白质水平显著低于癌旁组织。由于apoM涉及肝细胞癌发病机制，因此首先验证了apoM对HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响。用慢病毒空载体(LV-Mock)或过表达人类apoM慢病毒载体(LV-apoM)转染HepG2细胞。通过蛋白印迹分析法评价HepG2细胞中apoM蛋白表达。与慢病毒空载体处理细胞组相比，过表达apoM的细胞apoM表达水平显著地升高。用transwell实验研究apoM对HepG2细胞迁移和侵袭的影响。与转染慢病毒空载体的HepG2细胞相比，感染过表达apoM慢病毒载体的HepG2细胞迁移和侵袭能力的显著减低。然后，观察采用CCK-8实验检测apoM的表达是否影响HepG2细胞的生存和增殖。结果表明，过表达人类apoM慢病毒载体处理，减低存活的HepG2细胞的比例。通过流式细胞术，研究apoM对细胞周期的影响。如图1D所示，与对照组相比，感染apoM后，在G1期细胞百分数有所增多，在S期细胞百分数有所减少，在G2期细胞和M期细胞百分数没有改变。通过流式细胞术，用联合标记钙磷脂结合蛋白V(AV)和碘化丙啶的方法，评价HepG2细胞感染慢病毒空载体和过表达人类apoM慢病毒载体后细胞凋亡情况。如图1E所示，与慢病毒空载体转染的HepG2细胞相比，转染过表达apoM慢病毒载体显著增加细胞凋亡百分数(86.48±2.33 vs.3.31±0.56，p=0.000)。综上，这些数据表明apoM在肝细胞癌中的重要的病理学作用。　　2.观察Hsa-miR-573对apoM表达影响的研究。　　既然研究表明，与癌旁组织相比，肝细胞癌组织的apoM mRNA和蛋白质水平显著更低;miRNAs通过与靶向mRNAs的3端非翻译区域相互作用，抑制基因表达。因此推测miRNAs可能参与apoM表达的调节。首先，用4个预测程序miRBase，PicTar，TargetScan和RNAhybrid去筛选靶向apoM的miRNAs。分析预测9个潜在的apoM-靶向的miRNAs，分别是:hsa-miR-145-5p，hsa-miR-145-3p、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-5p、hsa-miR-222-3p、、hsa-miR-766-5p、 hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573。随后用HepG2细胞，研究九个假定的miRNAs模拟物对apoM表达的影响。hsa-miR-145-5p、 hsa-miR-145-3p、hsa-miR-222-5p、hsa-miR-222-3p、 hsa-miR-766-5p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573的模拟物下调apoM mRNA的表达。另外，hsa-miR-145-3p、hsa-miR-766-5p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573的模拟物下调apoM蛋白表达。因此，hsa-miR-573模拟物显著下调apoM mRNA和蛋白质水平，且最低限度的自由能为-20.7 kcal/mol。采用荧光素酶实验研究，hsa-miR-573是否能直接调节apoM表达。在共转染hsa-miR-573和pMIR-apoM-野生型之后，荧光素酶活性显著地降低。如果把野生型换成突变型，这一效果完全消失。这些结果表明，hsa-miR-573通过直接靶向作用结合apoM的3’-UTR，抑制apoM的表达。　　结论：　　1、ApoM抑制HepG2细胞迁移、侵袭和增殖，同时促进细胞凋亡。2、通过靶向作用apoM的3’-UTR，Hsa-miR-573下调apoM的表达。3、Hsa-miR-573促进HepG2细胞侵袭、迁移和增殖，同时抑制凋亡。4、通过调节Bcl2A1表达，apoM促进HepG2细胞凋亡，hsa-miR-573抑制HepG2细胞凋亡。5、在其它的肝癌细胞系，ApoM抑制细胞侵袭、迁移和增殖，同时促进细胞凋亡。6、在裸鼠成瘤实验中，ApoM抑制肿瘤生长，反之hsa-miR-573促进肿瘤生长。7、在肝细胞癌病人中，血清apoM浓度升高，并且显示和AFP浓度呈正相关。