放射线杀伤正常和肿瘤细胞主要是通过直接作用于靶细胞导致DNA及其生物大分子损伤实现。在DNA直接损伤的过程中,细胞间信号转导,也就是间隙连接和炎症反应介导的旁效应在细胞、组织的化疗与放疗反应中发挥着重要作用。旁效应,即在有直接受到射线照射的细胞存在时,没有直接受到射线照射的细胞也表现出辐射损伤包括染色体畸变、基因组不稳定性,细胞增殖失控以及信号转导通路改变等。旁效应成为低剂量辐射研究的热点,但是直到目前,旁效应的产生的原因、机制以及生物学终点仍然不清楚。旁效应的产生过程伴随着大量的基因表达变化,基因表达改变是辐射旁效应一个重要表现,研究这些旁效应差异表达基因对我们探索辐射旁效应的发生机制具有重要意义。AP1S1(adaptor-related protein complex 1,sigma 1 subunit)属于AP-1受体蛋白家族AP-1分子上的一种连接蛋白,在细胞内吞和高尔基体转运蛋白过程中起作用。该蛋白是我们利用基因芯片筛选辐射旁效应基因差异表达过程中发现的变化最明显的基因之一,在旁效应细胞中表达显著增高(P<0.05),并随着剂量增加而增加。由于辐射旁效应的产生多是信号分子在细胞间相互传递的原因,而该基因又在细胞内吞中起重要作用,因此我们设想通过对辐射造成AHH-1细胞APlSl基因表达变化的研究间接了解APlSl基因在辐射诱导的旁效应损伤及在辐射旁效应发生中的作用。研究内容1.研究不同剂量60Coγ射线致人淋巴母细胞旁效应在微核形成率、细胞增值率、细胞周期及APlSl基因及蛋白表达变化。2.利用siRNA干扰技术抑制AHH-1细胞APlSl基因表达,明确APlSl表达对电离辐射旁效应作用的影响,了解抑制APlSl表达是否能对于辐射旁效应损伤有防护作用。研究方法1.制备辐射旁效应细胞模型。2.细胞增值率,MN形成率,细胞周期变化等指标检测AHH-1细胞旁效应情况；RT-PCR、Western Blot方法检测正常AHH-1细胞、受照AHH-1细胞和AHH-1旁效应细胞在照后8h和24h APlSl基因mRNA及蛋白水平表达情况。3.设计APlS1基因的siRNA,转染AHH-1细胞,RT-PCR、Western Blot方法验证siRNA的转染效率。4.转染后的AHH-1细胞与不同受照剂量的受照细胞共培养作为旁效应细胞,阴性对照组和未转染组作为对照组。检测转染AP1S1siRNA的旁效应细胞组增值率变化；24h培养液中NO水平变化；MN形成率变化；细胞周期变化。5.统计学方法：SPSS13.0统计软件处理数据。结果1.芯片验证：与正常对照相比,直接受照细胞和旁效应细胞中APlSl基因mRNA水平、蛋白水平变化均较明显；受照细胞及旁效应细胞中APlSl基因在不同照射剂量、不同时间点均有显著上调,其中旁效应细胞上调更加明显。2. siRNA干扰：三对不同的siRNA的转染效率,AP1S1-1siRNA转染效率较高,APlSl-2次之,APlSl-3转染效率较低。3.CCK-8检测细胞增值率：与正常对照组相比AHH-1旁效应细胞增值率在不同剂量,不同时间点均有降低；APlSl-1组细胞增殖率在不同剂量,不同时间点均高于阴性对照组及未转染组(P<0.05),APlSl-2组(P>0.05),APlSl-3组增值率与阴性对照组相近,转染效果最差,这与转染效率测定结果基本吻合。4.细胞培养液中NO含量测定：各转染组及阴性对照组NO含量相比变化不大(P>0.05),无统计学意义。5.微核形成率：与正常对照组相比AHH-1旁效应细胞微核形成率在不同照射剂量及时间点均有增高；APlSl-1组MN形成率与阴性对照组及正常对照组相比降低,且差异显著(P<0.05)；APlSl-2组、APlSl-3组MN形成率与阴性对照组及正常对照组相比差异不显著(P>0.05)。6.细胞周期：正常旁效应细胞出现G2期阻滞；APlSl-1组旁效应细胞G2期阻滞程度较相应的阴性对照组大。结论1.APlSl基因在辐射旁效应中表达显著上调,其可能在辐射旁效应中扮演重要角色。2.抑制APlSl基因的表达,可降低旁效应细胞的微核形成率,提高旁效应细胞的增值率,说明APlSl可能在介导旁效应损伤中起作用。3.转染后旁效应细胞24h细胞培养液中NO水平变化不显著,说明抑制APlSl表达对NO这一最新的旁效应明星分子的释放与运输无影响,APlSl可能在NO介导旁效应的途径中不起作用。4.细胞周期正常AHH-1旁效应存在和直接受照细胞类似的G2期阻滞现象；转染的旁效应细胞G2期阻滞程度较相应的阴性对照组大,说明APlSl表达下调可加大G2期阻滞程度,促进细胞在G2/M检查点之前完成DNA损伤修复。