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猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)引起的一种病毒性疾病，临床症状以脑炎、心肌炎和母猪繁殖障碍为主，仔猪感染后致死率较高。本研究利用反向遗传操作技术成功构建了猪脑心肌炎病毒分离株BD2的全长感染性cDNA克隆，并在编码先导蛋白的基因中插入外源基因，构建出重组病毒，以期为深入研究EMCV的分子致病性与免疫机理、基因功能和新型病毒载体的构建及其新型疫苗的研制提供了技术平台。 根据EMCV BD2全基因组序列，设计三对覆盖病毒全基因组的重叠引物扩增三个片段，然后将其依次连接至已改造的低拷贝质粒pWSK29s，构建出BD2全长cDNA克隆(pWSKBD2)。经测序显示，该全长质粒5端成功引入了SP6原核启动子，5-UTR的poly(C)长度为31nt，3-UTR的poly(A)长度为18 nt。pWSKBD2全长质粒经BamHⅠ酶切线化、体外转录，得到具有感染性的EMCV RNA，经脂质体2000转染BHK-21细胞，24h后出现典型的细胞病变(CPE)，收集培养上清，连续传至5代后，经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定，证实获得具有感染性的拯救病毒，命名RvEMCV/BD2。第5代拯救病毒TCID50达到108/mL。一步生长曲线显示，拯救病毒RvEMCV/BD2在BHK-21细胞上的增殖特点与亲本毒株BD2差异不显著。 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)的ORF2基因编码核衣壳蛋白（Cap蛋白），该蛋白含有病毒主要抗原表位，是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。基于构建好的EMCV感染性克隆全长质粒，采用融合PCR技术，在编码病毒先导蛋白的L基因中插入猪圆环病毒的ORF2基因，构建出重组病毒，经酶切线化、体外转录，获得具有感染性的重组病毒，将其命名为RvEMCV/BD2-ORF2。结果表明该重组拯救病毒可在BHK-21细胞上稳定增殖并稳定携带外源基因，增殖动态分析表明，重组拯救病毒与BD2全长cDNA感染性克隆拯救病毒的增殖动态相似。