脑缺血是一种严重威胁人类生命健康的脑血管疾病。缺血缺氧会导致炎性级联反应、释放自由基、诱导神经元凋亡坏死和脑水肿在内的一系列损伤,严重者可能肢体瘫痪或危及生命。脑缺血后的神经保护受多种因素的调节,因此有关脑缺血康复的干预措施也具有多靶点、多水平和多通道的特点。研究表明,通过抑制氧化应激和炎性反应可以减少细胞凋亡或者坏死,达到缓解和治疗脑缺血相关症状的效果。多项基础和临床研究证实,雌激素可以通过抑制兴奋性氨基酸的释放、抗炎以及抗凋亡等多个方面对脑缺血具有神经保护作用。芒柄花素(FN,formononetin)作为一种异黄酮类植物雌激素,具有抗肿瘤、降血脂、抗脂质过氧化、抗炎性和雌激素等生理功能,芒柄花素磺酸钠(Sul-F,sodium formononetin-3’-sulfonate)是其磺化衍生物,极大提高了水溶性。研究表明,Sul-F对脑缺血具有神经保护作用,但其具体作用机制尚不明确。我们推测Sul-F能够通过抗炎、抗氧化和抗凋亡发挥其保护作用。本研究从在体和离体两个层面探究Sul-F对脑缺血损伤的保护作用及相关分子机制。首先建立C57BL/6小鼠永久局灶性脑缺血模型(pMCAO),通过神经功能评分、脑梗死体积和小胶质细胞的激活证实Sul-F对脑缺血损伤的神经保护作用;进一步建立PC12细胞缺氧模型,采用免疫荧光和蛋白免疫印迹等技术揭示Sul-F通过抗氧化应激和细胞凋亡保护脑缺血损伤的分子机制。研究结果:1.Sul-F显著减轻小鼠局灶性脑缺血损伤。连续一周以10mg/kg的剂量对C57BL/6雄性小鼠进行腹腔注射Sul-B制备pMCAO模型,生理盐水组作为对照,评估其神经功能、脑梗死体积和海马缺血侧SGZ区小胶质细胞的激活。结果显示,Sul-F能显著降低脑缺血后的神经功能评分和脑梗死体积,抑制小胶质细胞的激活。2.Sul-F显著抑制缺氧导致的PC12细胞活力降低。以0.1-1280μM的Sul-F对正常培养的PC12细胞进行24h预处理,MTT法检验细胞毒性;利用PC12细胞构建缺氧损伤模型,筛选最佳缺氧损伤时间点。发现当Sul-F浓度大于160μM时,它对细胞有毒害作用;细胞缺氧48h时,存活率约为50%,适合作为模型进行后续实验。以0.1-160μM的Sul-F对PC12细胞进行24h预处理,缺氧48h,正常培养的细胞作为对照组,MTT法检测其细胞活力。结果显示,Sul-F能显著提高缺氧后细胞的存活率,且浓度为20和40μM时存活率最高,因此选择20μM作为后续实验的加药浓度。LDH试剂盒检测乳酸脱氢酶释放,说明Sul-F能显著抑制缺氧导致的细胞损伤。3.Sul-F显著抑制缺氧导致的氧化应激。以20μM的Sul-F对正常培养的PC12细胞进行24h预处理,缺氧12h、24h和48h后,检测其ROS水平;以20μM的Sul-F对正常培养的PC12细胞进行24h预处理,缺氧48h后,检测其MDA和MMP水平。ROS、MDA和MMP水平结果显示,Sul-F能使细胞缺氧12h后的ROS水平显著下降,缺氧48h后的MDA水平显著下降,线粒体膜电位显著上升。缺氧后细胞中ROS含量上升,MDA生成增多,线粒体膜电位下降,Sul-F处理可以显著抑制缺氧诱导的ROS和MDA的生成以及线粒体膜电位的下降。4.Sul-F显著抑制缺氧导致的细胞凋亡。以20μM的Sul-F对正常培养的PC12细胞进行24h预处理,缺氧48h后,Hoechst/P[染色检测其细胞死亡水平,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达及AKT/ERK信号通路的变化。发现Sul-F能显著降低缺氧导致的细胞死亡以及Cleaved Caspase-3、Bax和Cleaved PARP的表达,同时发现Sul-F可以显著抑制缺氧导致的Akt/Erk磷酸化水平的降低。结论:1.Sul-F对小鼠脑缺血损伤发挥显著的神经保护作用,表现为神经功能评分和脑梗死体积的下降以及对活化小胶质细胞的抑制。2.Sul-F通过调节AKT/ERK信号通路降低氧化应激水平,进一步抑制细胞凋亡发生,从而实现神经保护作用。