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目的:牙周炎患者口内长期处于慢性炎症环境之中,对于口腔骨组织再生与修复重建能力有直接的影响,分析其原因或与牙周膜干细胞(ligament,)长期处于炎症微环境下致使原有生物学功能受损相关,其成骨分化能力可能受到了一定的抑制。内质网应激(stress,)在真核细胞中广泛存在,是一种保护性应激反应,能诱发非折叠蛋白反应(protein,UPR)。ERS可通过调节作用蛋白质功能翻译、降低蛋白质生物合成、促进内质网降解等来维持细胞稳态。既往研究已证实,ERS同炎症发生及发展均存在着密切的关联。在牙周组织工程中,源自牙周炎患者的牙周膜干细胞(Periodontal PDLSCs,P-PDLSCs)是修复受损的牙槽骨和牙周结缔组织的有潜力和易获得的干细胞之一。然而,慢性牙周炎炎症微环境会影响P-PDLSCs的成骨分化能力,这对牙周组织修复不利。低强度脉冲超声(Low-,LIPUS)可以提高体外培养的健康牙周膜干细胞(Healthy PDLSCs,H-PDLSCs)的成骨分化能力并降低脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)引起的炎症因子的表达,但LIPUS的功能作用机制研究尚不清楚。因此,本课题通过将P-PDLSCs和H-PDLSCs分别在体外分离培养,研究两种细胞中内质网应激的产生和UPR信号分子激活情况,通过体外实验探讨LIPUS对炎症状态下的PDLSCs的成骨分化和炎症诱导的影响以及内质网应激在此过程中的作用,通过体内实验评价LIPUS和内质网应激对牙周组织修复的影响,以期为LIPUS应用于牙周组织再生工程提供更坚实的依据,促进LIPUS在干细胞治疗领域的广泛应用。方法:1.PDLSCs的体外分离培养与鉴定:刮取牙周炎患者来源的牙周膜组织和健康组织来源的牙周膜,采用组织块酶消化法分离培养出人的和H-。尔后,检测上述两种的细胞表面标记物表达和成骨分化能力。2.观察P-PDLSCs的内质网应激和成骨分化能力的改变:通过透射电子显微镜比较两种PDLSCs的内质网形态;CCK-8比较细胞增殖情况;qRT-PCR和Western Blot分别检测与内质网应激、炎症和成骨分化相关的基因(GRP78,CHOP,IL-6,RUNX2)和蛋白(ALP,IRE1α,RUNX2)的表达情况。3.观察ERS在LIPUS抑制P-PDLSCs炎症和促进成骨分化中的作用:为了优化LIPUS的强度和4-PBA的使用剂量,在不同时间的LIPUS(30分钟,60分钟,90分钟,120分钟)和不同浓度的4-PBA(从1mM到10mM)处理下,CCK-8检测细胞增殖。实验分为四组:(1)P-PDLSCs组;(2)P-PDLSCs+LIPUS组;(3)P-PDLSCs+4-PBA组;(4)P-PDLSCs+LIPUS+4-PBA组,而后通过透射电镜分别观察每组的内质网形态,ELISA检测炎性细胞因子(IL-6,IL-8)的分泌,再用qRT-PCR和Western Blot分别检测与UPR、炎症和成骨相关的基因(GRP78,IRE1α,ATF4,IL-6,IL-8,RUNX2)和蛋白(PERK,ALP,GRP78,IRE1α/P-IRE1α,RUNX2,PDI)的表达,最后在成骨诱导7天和21天后用ALP染色和茜素红染色观察成骨分化能力变化。4.观察LIPUS和ERS对体内实验性牙周炎的修复作用:在大鼠口腔内用结扎丝结扎和局部LPS注射来建立大鼠牙周炎模型,分别在LIPUS或4-PBA处理28天后,用Micro-CT和H&E染色观察各组牙槽骨丧失情况。结果:1.原代P-PDLSCs和H-PDLSCs均呈成纤维组织细胞样形态,贴壁生长;流式检测间充质干细胞表面分子标记物(CD73和CD146)均呈阳性,而造血细胞表面标记物CD34呈阴性。CCK-8显示三天后P-PDLSCs的增殖率较H-PDLSCs显著增加,茜素红染色结果提示P-PDLSCs成骨分化能力下降。2.透射电镜结果显示P-PDLSCs的内质网形态发生改变;定量RT-PCR和WB显示P-PDLSCs中UPR信号分子(CHOP,GRP78,IRE1α)和炎症(IL-6)相关的基因、蛋白表达量增加,而成骨(RUNX2,ALP)相关的基因和蛋白减少,说明P-PDLSCs中炎性因子增加和成骨分化能力受损可能与慢性炎症引起的UPR活化有关。3.CCK-8结果显示LIPUS处理30分钟可以显著促进细胞增殖,而4-PBA(5mM)预处理8h对细胞增殖几乎没有影响,毒性水平较低;ELISA检测发现LIPUS和4-PBA均可降低P-PDLSCs中IL-6和IL-8的表达;qRT-PCR和Western Blot显示LIPUS和4-PBA处理减少了与UPR信号分子(GRP78,IRE1α/P-IRE1α,ATF4,PERK,PDI)和炎症(IL-6,IL-8)相关的基因和蛋白的表达,而增强了成骨(RUNX2,ALP)相关的基因和蛋白表达;ALP染色和茜素红染色也证明了LIPUS和4-PBA可以促进细胞的成骨分化能力。4.体内实验Micro-CT结果显示实验性牙周炎的牙槽骨明显吸收,而LIPUS或4-PBA处理后的牙槽骨损失率(ABLs/RBLs)比实验性牙周炎组低,H&E染色显示LIPUS或4-PBA治疗后均能部分恢复牙槽骨的高度,促进牙周组织再生。结论:1.牙周炎来源的P-PDLSCs产生内质网应激,导致细胞的UPR信号活化,炎症表达增加而成骨分化能力降低。2.LIPUS与内质网应激抑制剂4-PBA均能明显降低UPR信号分子的表达,显著增强P-PDLSCs的成骨分化能力并减少炎症因子释放,提示LIPUS可以通过减轻内质网应激从而降低P-PDLSCs的炎症并增强其成骨能力。3.LIPUS和4-PBA在体内均可部分恢复受损牙周组织的牙槽骨高度,进一步促进牙周组织再生。