罗汉果学名Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffery ex lu et Z.Y.Zhang,为主要分布于中国广西北部的葫芦科多年生草质藤本植物。罗汉果以果实入药,味甘性凉,归肺、大肠经,有润肺止咳,生津止渴的成效,适用于肺热或肺燥咳嗽,百日咳及暑热伤津口渴等,此外还有润肠通便的作用。罗汉果的主要药用成分为罗汉果苷化合物,其中罗汉果甜苷V是低热量、纯天然的甜味剂,还具有抗氧化、免疫调节、抗癌、降血糖等作用。但罗汉果苷目前还不能化学合成,主要依靠从植物中提取获得,产量受到罗汉果种植环境及条件的制约。因此研究罗汉果苷生物合成途径关键酶的异源表达,可为提高罗汉果苷类在植物中生物合成产量,为利用植物基因工程、细胞工程工业化生产罗汉果苷奠定理论基础。其次对罗汉果鲨烯合酶结构的分析,研究影响酶活性的关键基团,促进罗汉果苷化合物的生物合成研究。第一章罗汉果鲨烯合酶基因的克隆及酶分子结构分析目的:克隆罗汉果鲨烯合酶基因,获完整的鲨烯合酶开放阅读框架序列,推衍出相应的氨基酸序列,利用生物信息学技术分析罗汉果鲨烯合酶的酶结构,研究鲨烯合酶蛋白中与酶活性相关的氨基酸位点。方法:从GenBank上下载了陆生植物的鲨烯合酶基因序列,比对并分析鲨烯合酶的开放阅读框（ORF）,鲨烯合酶ORF的5′端序列高度保守,而3′端序列变化较大。根据陆生植物鲨烯合酶的ORF比对结果,以中段的保守序列设计引物,扩增罗汉果鲨烯合酶中段的300 bp左右的高度保守片段,测序列后,设计3′race引物,扩增后克隆测序获完整3′末端序列,根据3′末端序列及5′端高度保守序列设计引物扩增罗汉果鲨烯合酶ORF。将扩增产物克隆后测序,获得罗汉果鲨烯合酶ORF序列。将获得的罗汉果鲨烯合酶基因序列置于NCBI上,以Open Reading Frame Finder分析ORF,以DNASTAR将获得的ORF序列翻译为氨基酸序列,用ProtScal及ProtParam分析罗汉果鲨烯合酶蛋白的疏水性/亲水性,NetPhos2.0 Server对蛋白质磷酸化位点进行预测。以DNASTART软件中的protean以及在线网站NPS@分析其二级结构;结构域预测在NCBI CD-Search网站上进行。以TMHMM Server v.2.0分析其跨膜区。通过在线软件SWISS-MODEL对罗汉果鲨烯合酶蛋白质的三级结构进行预测,RASTOP 2.0软件进行编辑。从GenBank中下载植物鲨烯合酶基因,布朗葡萄藻为outgroup,以clustalx1.8对已报道的绞股蓝、香瓜、黄瓜、人参、丹参、拟南芥、甘草、番茄、马铃薯、烟草、玉米等物种的鲨烯合酶氨基酸序列进行比对分析,并构建了系统进化树,在MEGA5.0软件进行UPGMA算法构建系统树,并进行1000次的Bootstrap测试。结果:罗汉果鲨烯合酶基因ORF编码417个氨基酸,等电点为7.337。氨基酸序列中与酶活性中心相关的⁴⁷VSRSF⁵²、Y⁷⁰、R⁷⁴、⁷⁷DTVED⁸¹、Y¹⁶⁴、G²⁰²、L²⁰⁵、²¹²RDYLED²¹⁷、R²²⁵均高度保守。NetPhos2.0 Server分析提示罗汉果鲨烯合酶基因共有17个磷酸化位点,其中丝氨酸（Ser）磷酸化位点7个,分别为S⁴⁸、S¹⁹⁶、S²⁴⁹、S²⁸¹、S³⁴⁹、S³⁵⁸、S⁴⁰⁷;苏氨酸（Thr）磷酸化位点6个,分别为T⁷⁸、T⁸³、T¹⁴⁴、T¹⁶¹、T³¹⁸、T³²⁷;酪氨酸（Tyr）磷酸化位点4个,分别为Y¹⁶⁵、Y²³⁶、Y²⁴⁵、Y²⁷³;其中,S⁴⁸恰好位于与酶活性中心相关⁴⁷VSRSF⁵²模体中,S¹⁹⁶磷酸化位点为陆生植物鲨烯合酶基因的正选择位点。Prot Param分析结果提示罗汉果鲨烯合酶为亲水性蛋白。二级结构分析提示,罗汉果鲨烯合酶的二级结构中α螺旋占64.99%,延伸主链占7.19%,无规则卷曲占27.82%,罗汉果鲨烯合酶主要由α螺旋构成。结构域预测结果提示,罗汉果鲨烯合酶属于异戊二烯合酶家族,具结合法呢酰基焦磷酸及镁离子的结合位点,以及富含天冬氨酸模体。跨膜区分析提示,罗汉果鲨烯合酶具两个跨膜区,分别为282到304氨基酸之间及386到408氨基酸之间。罗汉果鲨烯合酶基因ORF与其它植物鲨烯合酶基因进行核苷酸序列比对构建系统树,同属一个科目的植物鲨烯合酶基因优先聚类合并,与植物自然进化关系保持一致。三级结构预测提示,罗汉果鲨烯合酶为单体蛋白结构,其活性中心主要由几个α螺旋围绕形成一穴状活性中心结构。结论:罗汉果鲨烯合酶为单体酶,二级结构以α螺旋为主,具结合法呢酰基焦磷酸及镁离子的保守结构域,C端具两个疏水性跨膜螺旋,氨基酸残基S⁴⁸和S¹⁹⁶可能是酶活性调节的关键位点。第二章罗汉果鲨烯合酶原核表达载体的构建及酶纯化与酶活性鉴定目的:建立罗汉果鲨烯合酶原核表达系统,实现罗汉果鲨烯合酶异源表达,建立酶活性检测的方法并研究酶促反应的特点,为进一步研究罗汉果鲨烯合酶的结构与功能提供了实验基础。方法:设计带BamHI及XhoI酶切位点特异性引物扩增罗汉果鲨烯合酶基因后克隆入T-easy载体构建pGEM-SS-ORF1,BamHI及XhoI双酶pGEM-SS-ORF1、pET-21a（+）和pET-28a（+）,分别胶回收罗汉果鲨烯合酶基因片段及酶切后的pET-21a（+）和p ET-28a（+）质粒,连接转化入大肠杆菌JM109。测序证实后提取质粒pET-28a（+）-SS及pET-21a（+）-SS转入BL21（DE3）表达菌株,获p ET-28a（+）-SS表达菌株及pET-21a（+）-SS表达菌株。加入IPTG诱导pET-28a（+）-SS表达菌株及p ET-21a（+）-SS表达菌株表达罗汉果鲨烯合酶,His镍柱纯化罗汉果鲨烯合酶,建立酶活性检测方法检测酶活性以及酶促反应的最佳pH值、最适温度及Km值。结果:测序结果提示pET-21a（+）和p ET-28a（+）质粒构建正确,IPTG诱导后pET-21a（+）-SS表达菌株正确表达罗汉果鲨烯合酶而p ET-28a（+）-SS表达菌株表达罗汉果鲨烯合酶效果不理想。经His镍柱纯化后原核表达的罗汉果鲨烯合酶具有酶的活性。罗汉果鲨烯合酶酶促反应最佳温度为37℃,最适pH值为7.5,以FPP为底物的Km值为5.5μM。结论:原核表达系统可表达具酶活性的罗汉果鲨烯合酶,罗汉果鲨烯合酶酶促反应最佳温度为37℃,最适pH值为7.5,以FPP为底物的Km值为5.5μM。第三章罗汉果鲨烯合酶氨基酸残基S⁴⁸和S¹⁹⁶对酶活性的影响目的:研究罗汉果鲨烯合酶氨基酸残基S⁴⁸和S¹⁹⁶对酶活性的影响。方法:设计包含kozak序列、BamHI及XhoI酶切位点特异性引物扩增罗汉果鲨烯合酶基因后克隆入pcDNA3.1载体构建pcDNA3.1-SS,将其转染入真核细胞HepG2中,以G418筛选转染后的细胞建立稳定转染细胞HepG2.SS,裂解HepG2.SS细胞,提取鲨烯合酶蛋白,加入法呢基焦磷酸、NAPDH酶反应体系,气相色谱检测生成物鲨烯浓度。分别设计包含突变位点的引物,以pcDNA3.1-SS为模板,加入高保真酶进行PCR反应,DpnI消化PCR产物,转化入XL10感受态细菌中。挑取菌落进行PCR初步鉴定,提取阳性克隆质粒,测序鉴定突变位点获pcDNA3.1-SS-S⁴⁸,pcDNA3.1-SS-S¹⁹⁶,pcDNA3.1-SS-S⁴⁸-S¹⁹⁶三种质粒,分别将三种突变质粒转染HepG2细胞,以G418筛选转染后的细胞建立稳定转染细胞HepG2.SS.48,HepG2.SS.196,HepG2.SS.48.196,裂解细胞,提取鲨烯合酶蛋白,加入法呢基焦磷酸、NAPDH酶反应体系,气相色谱检测生成物鲨烯浓度。结果:酶切及测序证实所获得的pcDNA3.1-SS载体构建正确,G418筛选一个月后获得稳定表达罗汉果鲨烯合酶的细胞HepG2.SS。酶活性检测证实所表达的罗汉果鲨烯合酶具有酶活性。菌落PCR及测序均证实获得突变位点正确质粒,G418筛选一个月后获得稳定表达罗汉果鲨烯合酶的细胞HepG2.SS.48,HepG2.SS.196,HepG2.SS.48.196分别表达SS-S48A、SS-S196A、SS-S48A-S196A。酶活性检测提示SS-S48A、SS-S196A、SS-S48A-S196A均具酶活性,SS-S48A酶活性为野生型SS的1.21倍（P（27）0.01）,SS-S196A酶活性为野生型鲨烯合酶的1.01倍,SS-S48A-S196A酶活性为野生型鲨烯合酶的1.16倍（P（27）0.01）。结论:罗汉果鲨烯合酶氨基酸残基S⁴⁸是酶活性调节的关键位点。第四章罗汉果鲨烯合酶在植物组织器官表达模式分析目的:研究鲨烯合酶基因在罗汉果组织器官中的表达模式,为提高罗汉果甜苷在果实中的积累提供理论及实验基础。方法:从授粉后30天罗汉果根、茎、叶及果皮中提取总RNA,并以随机引物反转录;克隆罗汉果18S基因并测序,根据测序结果设计扩增18S基因的荧光定量PCR引物;设计扩增罗汉果鲨烯合酶基因的荧光定量PCR引物;以18S作为内参基因,采用SYBGreen染料法,相对定量的方法进行进行荧光定量PCR。最后以2^{-（35）（35）C T}的方法处理数据。结果:罗汉果鲨烯合酶基因茎和根中表达较高,而在果皮及叶中表达较根、茎低,果皮鲨烯合酶表达是叶子的1.25倍,茎鲨烯合酶表达是叶子的2.60倍,根鲨烯合酶表达是叶子的2.51倍。结论:从授粉后30天鲨烯合酶在根茎中含量高于叶子及果皮,提示罗汉果苷类物质在根茎中合成较为活跃。