脑缺血/再灌注损伤严重威胁着人们的生命和生存质量，如何有效地预防和减轻缺血性脑损伤已成为目前医学研究的重点之一。谷氨酸是一种重要的兴奋性神经递质，也是导致脑损伤最主要的兴奋性氨基酸。在生理状态下，神经细胞外的谷氨酸浓度处在一种动态平衡中；病理情况下，由于谷氨酸产生过多或代谢异常，在突触间隙大量蓄积，造成神经细胞的损伤。位于胶质细胞表面的谷氨酸转运体将谷氨酸转运至胶质细胞内，由谷氨酰胺合成酶代谢为无神经毒性的谷氨酰胺。因此，调节谷氨酸转运体功能、维持神经细胞外谷氨酸浓度正常水平，对预防和减轻神经细胞损伤具有重要作用。我们实验室率先报道电针刺激大鼠“百会穴”，可模拟缺血预处理产生“脑缺血耐受”效应，从而提出“电针预处理”的概念；同时我们探索发现电针预处理脑缺血耐受效应的穴位特异性（百会穴）和最佳刺激参数（2/15Hz,1mA,30min/d,5d）。并进一步研究证实电针预处理可增加脑组织内源性大麻素配体（2-AG和AEA）合成，增强神经元大麻素受体（CB1）表达，上调ERK1/2磷酸化水平，但激活内源性大麻素系统减轻谷氨酸对神经细胞损伤的机制尚不清楚，有待进一步研究。因此，我们采用细胞培养方法，观察CB2激动剂预处理是否通过影响小胶质细胞兴奋性氨基酸转运体（EAAT）对抗谷氨酸毒性，发挥神经保护作用。第一部分CB2受体激动剂预处理对谷氨酸所致小胶质细胞损伤的保护作用方法1研究不同浓度谷氨酸对小胶质细胞存活率的影响将小胶质细胞分6组，分别用含0mmol/L谷氨酸（Control组）和含1、3、5、10、20mmol/L5个不同浓度谷氨酸的培养基培养小胶质细胞24h，应用MTT法检测各组细胞存活率2研究不同浓度CB2受体激动剂预处理对小胶质细胞存活率的影响将小胶质细胞分为6组，分别为谷氨酸组和浓度为0.5、1、2、3和5μmol/L CB2受体激动剂AM1241预处理组，预处理小胶质细胞2h后用正常培养基培养2h，再更换含10mmol/L谷氨酸的培养基培养24h后，采用MTT法检测各组细胞存活率。3观察CB2受体激动剂预处理对谷氨酸所致小胶质细胞损伤的保护作用小胶质细胞被分为6组，分别为Control组、AM1241组、AM630组、谷氨酸（Glu）组、AM1241+Glu组和AM1241+AM630+Glu组，其中，Control组正常培养28h；AM1241组和AM630组小胶质细胞分别为2μmol/LCB2激动剂AM1241或6μmol/L CB2拮抗剂AM630预处理2h后，更换培养基正常培养26h；而AM1241+Glu组和AM1241+AM630+Glu组细胞分别用含2μmol/LAM1241和同时含2μmol/LAM1241与6μmol/LAM630的培养基培养2h后，换用正常培养基培养2h，再更换含10mmol/L Glu的培养基损伤24h，最后，各组分别采用MTT法检测细胞存活情况、乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒测定细胞培养基中LDH漏出量并使用倒置相差显微镜观察细胞形态变化。结果1不同浓度谷氨酸对小胶质细胞存活率的影响与Control组相比，1、3、5、10、20mmol/L谷氨酸损伤均可显著降低小胶质细胞存活率（P<0.05），其中10mmol/L谷氨酸损伤可使细胞存活率下降至Control组的50%左右。2不同浓度CB2受体激动剂预处理对小胶质细胞存活率的影响与谷氨酸组相比，1、2、3、5μmol/L CB2受体激动剂AM1241预处理均可使小胶质细胞存活率升高（P<0.05），其中2μmol/L AM1241预处理保护作用最强。3CB2受体激动剂预处理对谷氨酸所致小胶质细胞损伤具有保护作用3.1细胞存活率与Glu组相比，AM1241+Glu组细胞存活率明显上升（P<0.05），而与AM1241+Glu组相比，AM1241+AM630+Glu组细胞存活率下降（P<0.05）。3.2乳酸脱氢酶（LDH）与Glu组相比，AM1241+Glu组细胞LDH漏出量明显下降（P<0.05），而与AM1241+Glu组相比，AM1241+AM630+Glu组细胞LDH漏出量上升（P<0.05）。3.3细胞形态Glu组大量细胞破坏碎裂，细胞轮廓增强，胞体粗糙，伪足消失；AM1241+Glu组细胞与Glu组相比破坏较轻，胞体略有增大，伪足消失较Glu组减少。而AM1241+AM630+Glu组细胞形态与Glu组相比无明显差异。第二部分小胶质细胞EAAT在CB2受体激动剂预处理减轻谷氨酸所致神经元损伤中的作用方法1观察CB2受体激动剂预处理小胶质细胞对谷氨酸所致神经元损伤的影响小胶质细胞被分为7组，分别为Control组、AM1241组、AM630组、Glu组、AM1241+Glu组、AM630+Glu组和AM1241+AM630+Glu组，其中，Control组正常培养30h；AM1241组和AM630组小胶质细胞分别为2μmol/L CB2激动剂AM1241或6μmol/L CB2拮抗剂AM630预处理4h后，更换培养基正常培养26h；而AM1241+Glu组和AM1241+AM630+Glu组细胞分别用含2μmol/LAM1241或6μmol/LAM630和同时含2μmol/LAM1241与6μmol/L AM630的培养基培养小胶质细胞4h后，换用正常培养基培养2h，再更换含10mmol/L Glu的培养基损伤24h，最后，吸取各组小胶质细胞的培养基培养神经细胞24h，采用MTT法检测神经细胞存活情况。2观察CB2激动剂预处理对小胶质细胞EAAT2表达量的影响小胶质细胞被分为4组，分别为Glu组、AM1241组、AM630组和TBOA组，其中，Glu组正常培养6h，换用含10mmol/L Glu的培养基损伤24h；AM1241组、AM630组和TBOA组小胶质细胞分别为2μmol/L AM1241、2μmol/L AM1241和6μmol/L AM630、同时含2μmol/L AM1241和100μmol/LTBOA的培养基预处理4h后，更换培养基正常培养2h，再更换含10mmol/LGlu的培养基损伤24h，最后进行Western blot检测和免疫荧光染色。3研究CB2受体激动剂预处理保护作用是否与小胶质细胞的EAAT相关小胶质细胞被分为7组，分别为Control组、AM1241组、TBOA组、Glu组、AM1241+Glu组、TBOA+Glu组和AM1241+TBOA+Glu组，其中，Control组正常培养30h；AM1241组和TBOA组小胶质细胞分别为2μmol/LCB2激动剂AM1241或100μmol/L EAAT拮抗剂TBOA预处理4h后，更换培养基正常培养26h；而AM1241+Glu组和AM1241+TBOA+Glu组细胞分别用含2μmol/LAM1241或100μmol/LTBOA和同时含2μmol/LAM1241与100μmol/L TBOA的培养基培养小胶质细胞4h后，换用正常培养基培养2h，再更换含10mmol/L Glu的培养基损伤24h，最后，吸取各组小胶质细胞的培养基培养神经细胞24h，采用MTT法检测神经细胞存活情况。结果1CB2受体激动剂AM1241预处理小胶质细胞对谷氨酸神经元损伤的影响与Glu组相比，AM1241+Glu组神经细胞存活率明显上升（P<0.05），而与AM1241+Glu组相比，AM1241+AM630+Glu组神经细胞存活率下降（P<0.05）。2CB2激动剂预处理对小胶质细胞EAAT2表达量的影响2.1Western blot检测CB2受体激动剂处理增加了EAAT2蛋白的表达量。Western blot结果显示，与Glu组相比，AM1241组EAAT2蛋白的表达显著增高(P<0.05)，与AM1241组相比， AM630组和TBOA组EAAT2蛋白的表达明显降低(P<0.05)。2.2免疫荧光染色免疫荧光染色照片显示，与Glu组相比，AM1241组红色荧光（EAAT2）增强；而与AM1241组相比，AM630组和TBOA组红色荧光明显减弱。3CB2受体激动剂预处理保护作用与小胶质细胞的EAAT相关与Glu组相比，AM1241+Glu组神经细胞存活率明显上升（P<0.05），而与AM1241+Glu组相比，AM1241+TBOA+Glu组神经细胞存活率下降（P<0.05）。小结1．CB2受体激动剂AM1241预处理可以减轻谷氨酸所致小胶质细胞的损伤， CB2受体拮抗剂AM630可以使其预处理保护作用消失，提示激动小胶质细胞CB2受体可使谷氨酸所致细胞损伤减轻。2．CB2受体激动剂预处理可增强小胶质细胞EAAT2的表达，应用CB2受体拮抗剂AM630或EAAT拮抗剂TBOA均可逆转CB2受体激动剂AM1241预处理小胶质细胞减轻谷氨酸对神经细胞损伤的保护作用，提示小胶质细胞的EAAT参与了CB2受体激动剂预处理诱导的神经保护作用。