目的:采用精密肝切片技术探讨何首乌致肝毒性的物质基础。方法:生何首乌经乙醇提取后,提取液回收至无醇味,浸膏加水分散至一定体积,再依次经乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别回收溶剂后得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水部位。将上述的乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水部位分别与肝切片共同培养6 h后制备肝组织匀浆,匀浆液中的蛋白含量采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法进行检测,连续监测法测定并计算每微克蛋白中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST),γ-谷氨酰氨基转肽酶(gamma-glutamine amino transpeptidase,GGT)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的漏出率,通过酶漏出率的大小筛选毒性部位,酶泄漏率越高说明该部位的肝毒性越大。利用硅胶、ODS、MCI柱层析、Sephadex LH-20、PHPLC、TLC等各种色谱技术对何首乌毒性部位的化学成分进行分离纯化,并通过MS、NMR等波谱分析及与标准物质进行薄层比对的方法鉴定化合物的结构。运用噻唑蓝比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测何首乌中游离蒽醌、结合蒽醌及萘类共11个单体成分对HepG2细胞的毒性,筛选出有肝细胞毒性的化合物,并进行相应的构效关系分析;采用精密肝切片(precision-cut liver slices,PCLS)技术对有细胞毒性的化合物进行验证,探讨何首乌导致肝毒性的物质基础。结果:何首乌3个不同的萃取部位分别与肝切片共同培养6 h,结果发现乙酸乙酯部位0.4 g·mL-1组能引起肝切片ALT,AST,GGT,LDH漏出率的显著升高(P<0.01或P<0.05),0.2 g·m L-1能引起肝切片ALT,GGT,LDH漏出率的显著升高(P<0.05或P<0.01)。相对于同等浓度下的正丁醇及水部位酶漏出率较大,毒性较强。因此,采用色谱技术对乙酸乙酯部位的化合物进行了分离纯化并鉴定出6个化学成分,分别为大黄素、w-羟基大黄素、大黄素甲醚-8-O-(6′-O-乙酰基)-β-D-葡萄糖苷、没食子酸、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷及大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷。MTT试验结果显示大黄酸、大黄素、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-(6′-O-乙酰基)-β-D-葡萄糖苷的IC50值分别为71.07,125.62,242.27,402.32μM,而其他7个化合物的毒性很小。采用PCLS技术对肝细胞毒性较强的成分大黄酸、大黄素及大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷的肝毒性进行进一步的验证,结果显示大黄酸400μM组能引起肝切片ALT,AST,LDH漏出率的显著升高(P<0.01),100μM能引起肝切片LDH漏出率的显著升高(P<0.05);随药物浓度增大,蛋白含量显著下降(P<0.05),且显示一定的量毒关系。大黄素400μM组可引起肝切片ALT,GGT,LDH漏出率的显著升高(P<0.01)。大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷800μM能引起肝切片ALT,AST,LDH漏出率的显著升高(P<0.01或P<0.05);200μM能引起肝切片LDH漏出率的显著升高(P<0.05),且随药物浓度的增大肝切片ALT,AST,LDH漏出率呈升高趋势、蛋白含量呈下降趋势。浓度为800μM的大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷与肝切片共培养6 h后MTT还原能力显著下降(P<0.01)。结论:大剂量的蒽醌类成分可能会导致肝毒性,但它们可能并不是何首乌致肝毒性的主要物质基础。本课题为国家自然科学基金“基于精密肝切片技术的何首乌致肝毒性物质基础研究(编号:81503238)”。