【摘 要】
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目的:五灵脂为中医临床常用的粪便类中药,其质量标准曾收录于1977年和1990年《中国药典》中,仅有性状和鉴别项,《陕西省药材标准》2015年版增加了显微鉴别和薄层色谱。质量标准研究的欠缺导致市售五灵脂品质良莠不齐,假冒伪劣现象层出不穷。本课题以五灵脂抗凝血作用为药效指标,结合化学指纹图谱,采用谱效关系研究方法,探寻五灵脂中的主要药效成分,同时对五灵脂质量控制指纹图谱以及胆酸类成分含量进行分析,为
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目的:五灵脂为中医临床常用的粪便类中药,其质量标准曾收录于1977年和1990年《中国药典》中,仅有性状和鉴别项,《陕西省药材标准》2015年版增加了显微鉴别和薄层色谱。质量标准研究的欠缺导致市售五灵脂品质良莠不齐,假冒伪劣现象层出不穷。本课题以五灵脂抗凝血作用为药效指标,结合化学指纹图谱,采用谱效关系研究方法,探寻五灵脂中的主要药效成分,同时对五灵脂质量控制指纹图谱以及胆酸类成分含量进行分析,为明确五灵脂抗凝血作用物质基础及完善五灵脂的质量标准提供依据。方法:1.采用超高效液相色谱-紫外可见光谱(UPLC-UV)技术建立五灵脂谱效关系指纹图谱,并对其进行超高效液相色谱-紫外可见光谱-线性离子阱-静电场轨道阱质谱(UPLC-UV-LTQ-Orbitrap MS)成分分析,结合紫外可见光谱(UV)指纹图谱信息,对谱效关系指纹图谱共有峰进行指认;采用高效液相色谱-紫外可见光谱(HPLC-UV)技术建立五灵脂的质量控制指纹图谱,并对方法进行UPLC转移研究后采用UPLC-UV-LTQ-Orbitrap MS成分分析技术对五灵脂中化学成分进行鉴别分析,结合UV指纹图谱信息,对质量控制指纹图谱共有峰进行指认。2.采用体外抗凝血实验评价五灵脂抗凝血作用,以凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)为指标对所收集到的五灵脂进行抗凝血活性测试。3.基于上述的指纹图谱和药效作用,采用灰色关联度法对各样品的谱效关系指纹图谱共有峰与抗凝活性的关联性进行分析,通过比较指纹图谱各共有峰与抗凝作用关联度的大小,初步探寻五灵脂抗凝血作用物质基础。4.采用总胆酸测定试剂盒对五灵脂中胆酸类成分进行含量测定,初步完善五灵脂质量标准。结果:1.建立的五灵脂谱效关系UPLC-UV指纹图谱共标定40个共有峰,指纹图谱的相似度在0.893～0.994之间,UPLC-UV-LTQ-Orbitrap MS共鉴别出38个成分,初步指认了 40个共有峰里的9个共有峰;建立的五灵脂质量控制HPLC-UV指纹图谱共标定了 14个共有峰,共有峰的相对保留时间和相对峰面积均符合要求,11批样品的指纹图谱相似度在0.825～0.999之间,UPLC-UV-LTQ-Orbitrap MS共鉴别出55个成分,初步指认了 14个共有峰里的6个共有峰。2.五灵脂体外抗凝血药效实验显示11批样品均表现出对TT有显著的延长作用。其中,S4样品的抗凝作用最好,TT、PT、APTT三个指标均表现出比其他样品更高的凝血时间延长率,其余样品对三个指标的影响各不相同。3.谱效关系结果显示五灵脂谱效关系指纹图谱40个共有峰代表的化学成分与抗凝血作用都有关联性,其中有13个共有峰与抗凝血作用关联性较大。4.总胆酸含量测定结果表明11批样品中均含有胆酸类成分,S8样品中的胆酸含量较多,S3、S4、S6、S11样品胆酸类成分测量结果一致,均为16.33 μmol·L-1。结论:本研究对五灵脂抗凝血作用谱效关系和质量标准进行了初步的探索和完善。首先从化学成分和药效作用两方面入手,建立了五灵脂谱效关系UPLC-UV指纹图谱,鉴别了五灵脂谱效关系样品的化学成分;同时对五灵脂的抗凝血功效进行评价,进而建立了五灵脂抗凝血作用谱效关系,初步筛选五灵脂发挥抗凝作用的物质基础。其次,建立了五灵脂质量控制HPLC-UV及UPLC-UV指纹图谱,鉴别了五灵质量控制样品的化学成分,对五灵脂中胆酸类成分进行了含量测定,进一步完善五灵脂的质量标准。
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