玉米DREB1/CBF转录因子的克隆及其抗逆功能分析

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玉米(Zea mays L.)是重要的粮食和经济作物,是世界上分布最广泛的粮食作物之一,同时也是重要的家畜饲料和工业原料。然而,干旱、盐碱和低温等环境因子经常对玉米的生长发育和产量产生严重的影响,也给玉米的农业生产造成了巨大的损失。研究表明,在植物对非生物胁迫的应答中,DREB/CBF转录因子起着重要的调控作用。它能特异的与DRE/CRT顺式作用元件结合,调控下游功能基因的表达,增强植物对干旱,高盐和低温等非生物胁迫的耐受能力。本研究从玉米品种B73中克隆得到了一个DREB1/CBF转录因子基因,即ZmDREB1B,并对其进行了结构分析和功能鉴定,主要研究结果如下:1.根据植物转录因子数据库中的序列信息设计特异性引物,通过PCR方法从玉米(B73)中克隆得到ZmDREB1B转录因子基因,该基因ORF全长783bp,编码260个氨基酸,无内含子,预测蛋白质分子量为28kDa,等电点为5.11,包含一个AP2/ERF结合域,在线软件预测该基因编码蛋白定位于细胞核中,氨基酸序列比对和系统进化分析结果表明该基因属于DREB/CBF转录因子A-4亚类。2.将ZmDREB1B基因进行了原核表达,SDS-PAGE电泳检测到目的蛋白正常表达,由于His-Tag的融合表达,表达蛋白分子量大小比预测结果较大,并发现其在大肠杆菌BL21中的表达量在8h~12h最高,为后续的研究奠定了基础。3.通过酵母单杂对ZmDREB1B的激活活性进行了分析,结果表明,该转录因子具有转录激活活性,属于转录激活因子。4.通过Overlapping PCR技术获得了ZmDREB1B∷eGFP融合基因,构建到植物表达载体后,利用农杆菌介导的洋葱表皮细胞遗传转化技术对其进行了亚细胞定位分析,结果显示ZmDREB1B蛋白定位在细胞核中。5.利用qRT-PCR对ZmDREB1B基因的组织表达特性和逆境诱导表达特性进行了分析。结果表明,ZmDREB1B在各组织中均有表达,不具有组织特异性表达模式,但它们在根部表达量明显高于其他组织。ZmDREB1B对干旱、高盐、低温、高温和ABA处理均存在不同程度的应答响应,但SA和MeJA处理后,其表达量并没有明显的变化。6.在原核生物大肠杆菌BL21菌株与真核生物酿酒酵母INVSc1菌株中对ZmDREB1B的抗逆功能进行了检测,结果表明,大肠杆菌BL21和酿酒酵母INVSc1重组菌株的抗逆能力明显高于野生对照菌株。7.将ZmDREB1B基因构建到植物表达载体pCHF-1301中,采用农杆菌介导的方法转化模式植物拟南芥,并筛选得到阳性转基因植株。对转基因拟南芥进行了干旱,高盐,冷冻等抗逆性分析并且对其相关生理指标进行了测定,并通过qRT-PCR分析了ZmDREB1B对下游抗逆相关功能基因的激活活性,结果显示ZmDREB1B转基因拟南芥植株对这些非生物胁迫均有较高的耐受能力,其过量表达也使下游功能基因的转录水平得到了明显的上调。
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