第一部分 苯染毒诱导急性髓系白血病动物模型的建立及特点[研究目的]苯是广泛存在于人们生产和生活环境中的化学物质,可由装修释放、职业暴露、烟草燃烧、汽车尾气等产生,是目前公认的可诱导白血病尤其是急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)发生的重要环境因素。长期慢性苯暴露主要损害造血系统,可引起白细胞总数、中性粒细胞计数以及血小板计数减低,全血细胞减少,再生障碍性贫血甚至白血病。基于流行病学证据,苯暴露引起的白血病类型主要为急性髓系白血病。白血病治疗费用较高,苯所致白血病的发生对社会造成的危害和影响程度较大。但是苯所致白血病的机制尚不完全清楚,且缺乏相应的动物模型。因此,系统的论证苯与白血病发生之间的关系,有着重要的社会意义和科学价值。采用皮下注射苯的染毒方法简单、易于操作,也比较接近于苯接触人群的实际暴露情况,因此本实验拟建立皮下注射苯染毒诱导AML动物模型,为进一步研究苯所致白血病的发病机制提供动物模型,并在此基础上寻找苯所致白血病的关键基因和通路。[研究方法]1.动物模型建立染毒组采用皮下注射苯玉米油(苯和玉米油的比例为1:9)混合溶剂(纯苯浓度为250mg/kg·d),每周连续注射6天,休息1天,直至建立苯染毒诱导的AML动物模型。对照组给予皮下注射同等剂量的玉米油。2.血常规检测染毒组与对照组在不同时期节点麻醉动物后取外周血,枸橼酸钠稀释10倍后,五分类血细胞分析仪检测两组小鼠血细胞计数,持续观察白细胞、红细胞、血小板数量变化规律。3.外周血涂片染毒组与对照组在不同时期节点麻醉动物后取外周血,进行血涂片,行瑞氏-吉姆萨染色,观察细胞形态。4.骨髓涂片染毒组与对照组麻醉后处死动物,取股骨骨髓,进行骨髓涂片,冲出后自然风干,再行瑞氏-吉姆萨染色,进行骨髓细胞学检查。5.组织病理学检查染毒组与对照组麻醉后处死动物,分别取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和骨髓组织,使用4%多聚甲醛固定,常规制作石蜡切片,HE染色、镜检。[实验结果]1.小鼠生存状态染毒初期,部分小鼠开始出现易激惹、精神略显亢奋,增重缓慢;随着染毒时间延长,小鼠体重下降,部分小鼠出现步态不稳、竖毛、弓背、皮毛粗糙、脱毛等症状。染毒过程中有小鼠出现恶液质表现,后死亡。对照组小鼠生长正常,未见此表现。2.外周血细胞计数在苯染毒后不同阶段,染毒组外周血白细胞计数呈现染毒初始阶段减少,白血病爆发阶段骤然升高的趋势。与对照组相比,染毒6月组外周血白细胞计数明显升高。染毒组红细胞、血小板计数总体呈现逐渐下降趋势。与对照组相比,染毒6月组外周血红细胞和血小板计数明显减少。3.血涂片染毒6月组血涂片显示啮齿类动物血片特点,有环形中性粒细胞、单核细胞、嗜多色红细胞、血小板,并可查见白血病细胞。对照6月组血涂片未见白血病细胞。4.骨髓涂片染毒6月组骨髓涂片提示骨髓中可见灶状成团分布的白血病细胞,细胞胞体较大,核浆比例失调,且原始细胞比例>30%。细胞化学染色示MPO阴性至弱阳性,PAS阴性,符合急性髓系白血病特点。表明皮下注射苯染毒6月时AML动物模型成功建立。对照6月组骨髓涂片未见明显异常。5.组织病理学检查染毒6月组小鼠肺脏正常组织结构破坏,肺泡固有的结构被弥漫增殖的肿瘤细胞所取代,瘤细胞形态基本一致,细胞胞体较大,核圆形而不规则,核染色质较疏松,核分裂象较多见。染毒6月组小鼠脾脏正常组织结构破坏,固有的结构被弥漫增殖的肿瘤细胞所取代,白血病细胞在脾小体和红髓内呈弥漫性浸润。染毒6月组小鼠骨髓组织增生异常活跃,可发现瘤细胞聚集。染毒6月组小鼠肝脏组织汇管区可见大小不一、形态各异的肿瘤细胞,可见核分裂象。对照6月组小鼠肺脏、脾脏、骨髓和肝脏病理学检查未见明显异常。染毒6月组和对照6月组小鼠心脏、肾脏病理组织均未见明显异常改变。[研究结论]实验结果表明,可通过皮下注射苯的染毒方式诱导AML,染毒6月时成功建立苯诱导AML小鼠动物模型。苯染毒影响小鼠的体重增长,对神经系统影响表现为先兴奋后抑制。苯染毒后外周血白细胞数量先下降后升高,血小板和红细胞计数逐渐减少,骨髓造血功能受到抑制。染毒过程中先出现苯中毒表现,后发生急性白血病。染毒6月组骨髓涂片可见较多原始细胞。染毒6月组骨髓病理检查可见骨髓组织增生异常活跃,脾脏、肝脏病理组织中亦可观察到明显的髓外肿瘤细胞浸润。此外,苯诱导白血病模型组中肺组织也是较早观察到肿瘤细胞浸润的器官。第二部分 Tim-3在苯诱导AML中的表达及免疫抑制作用[研究目的]苯是引起急性髓系白血病(AML)的重要环境致病因素,但其具体发生机制仍未明确。目前关于白血病发病机制的研究众多,其最终发生与白血病细胞增殖失控、凋亡受阻、分化障碍造成的克隆性增殖,以及由于免疫缺陷造成的肿瘤免疫逃逸两方面均密切相关。我们第一部分实验建立了苯染毒诱导AML的小鼠动物模型,较好的模拟了苯白血病过程中体内造血微环境变化,为深入研究苯所致白血病的发病机制提供了较为理想的动物模型。在肿瘤微环境中,肿瘤细胞、成纤维细胞及内皮细胞能通过产生多种趋化因子将肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的前体细胞—单核细胞招募到肿瘤部位,并将其由发挥免疫监视的M1型巨噬细胞“驯化”为发挥免疫抑制作用的M2型巨噬细胞,称为巨噬细胞极化。而TAMs通过分泌转化生长因子-β(TGF-β)等多种生长因子促进肿瘤生长,与肿瘤的发生及不良预后相关。负性共刺激分子(又称负性免疫检查点分子)对免疫应答的抑制作用作为一种重要的肿瘤免疫逃逸机制受到了 广泛关注。Tim-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3),全名T淋巴细胞免疫球蛋白粘蛋白3,作为一种免疫调节分子,在免疫学领域得到了广泛的研究。然而,Tim-3在血液学恶性肿瘤中的作用或表达的研究至今还很有限,尤其是在苯所致白血病中的研究尚未见报道。鉴于白血病高度恶性的生物特性以及与实体肿瘤的差异性,研究Tim-3在苯染毒诱导的AML中的表达及意义是有必要的。我们将通过负性免疫检查点分子Tim-3的表达变化与功能介导为切入点,进一步研究Tim-3在苯诱导AML发病过程中微环境的免疫抑制作用,为阐释苯所致白血病的发病机理、监测并干预苯的血液学毒性提供实验室基础,并为苯所致白血病的治疗提供免疫靶点。[研究方法]1.免疫细胞因子检测造模成功的染毒模型组(苯所致白血病模型组)和对照组实验动物分别进行眼眶取血,分离血清,依照Elisa试剂盒说明书进行操作,用酶标仪在450nm波长测染毒模型组和对照组实验动物血清IL-12、TGF-β1的含量。2.流式细胞术检测分别检测染毒模型组与对照组实验动物骨髓、脾脏及外周血的CD8+T细胞和CD14+单核细胞上Tim-3表达水平。3.免疫荧光染色检查(1)分别对染毒模型组与对照组实验动物进行免疫荧光法检测骨髓组织的F4/80(M1+M2)巨噬细胞上Tim-3的表达及CD206(M2型)巨噬细胞在(M1+M2)巨噬细胞中的表达。(2)分别对染毒模型组与对照组实验动物进行免疫荧光法检测脾脏组织的CD163(M2型)巨噬细胞在CD68(M1+M2)巨噬细胞中的表达。[研究结果]1.免疫细胞因子检测IL-12、TGF-β1(1)细胞因子IL-12染毒模型组血清IL-12较苯染毒前明显降低,分别为(128.65±62.06)pg/mL和(240.46±130.98)pg/mL,有统计学差异(p<0.05)。染毒模型组血清IL-12与对照组相比明显降低,分别为(128.65±62.06)pg/mL和(216.71±70.16)pg/mL,有统计学差异(p<0.05)。(2)细胞因子TGF-β1染毒模型组血清TGF-β1较苯染毒前明显升高,分别为(103.59±36.13)pg/mL和(54.03±21.07)pg/mL,有统计学差异(p<0.05)。染毒模型组血清TGF-β1与对照组相比明显升高,分别为(103.59±36.13)pg/mL和(76.84±15.73)pg/mL,有统计学差异(p<0.05)。2.流式细胞术检测骨髓、脾脏及外周血中CD8+T细胞、CD14+单核细胞Tim-3表达水平(1)骨髓细胞上Tim-3的表达:与对照组相比,染毒模型组骨髓CD8+T细胞、CD14+单核细胞Tim-3表达水平均明显升高(p<0.05)。(2)脾脏细胞上Tim-3的表达:与对照组相比,染毒模型组脾脏CD8+T细胞、CD14+单核细胞Tim-3表达水平均明显升高(p<0.05)。(3)外周血Tim-3的表达:与对照组相比,染毒模型组外周血CD8+T细胞、CD14+单核细胞Tim-3表达水平均明显升高(p<0.05)。3.免疫荧光检测骨髓巨噬细胞Tim-3的表达及骨髓、脾脏巨噬细胞极化状态(1)染毒模型组骨髓(F4/80)巨噬细胞上Tim-3的表达明显高于对照组。染毒模型组骨髓巨噬细胞CD206(M2型)极化程度较对照组显著增高。(2)染毒模型组脾脏巨噬细胞CD163(M2型)极化程度较对照组显著增高。[研究结论]1.免疫负调分子Tim-3在苯染毒模型组小鼠骨髓、脾脏、外周血CD14+单核细胞上的表达明显增高,且在该组小鼠骨髓巨噬细胞上的表达水平也明显高于对照组,表明苯染毒后可促进巨噬细胞Tim-3的表达。2.苯染毒模型组随着Tim-3表达的上调,血清M1型巨噬细胞功能标志物IL-12水平下降,M2型巨噬细胞功能标志物TGF-β1水平增高。苯染毒模型组骨髓和脾脏巨噬细胞中M2型巨噬细胞表达明显高于对照组,提示苯染毒可诱导巨噬细胞向M2型极化。3.Tim-3在苯染毒模型组小鼠骨髓、脾脏、外周血CD8+T细胞的表达水平亦明显增高,表明苯染毒后可促进免疫T细胞表面负调控分子的表达,抑制T细胞功能,进一步证实了免疫抑制在苯所致白血病发病中的作用。苯染毒诱导AML使Tim-3在多种免疫细胞上表达上调,通过巨噬细胞极化、减少促炎细胞因子分泌、促进抗炎细胞因子释放,使巨噬细胞的表型和功能发生改变,以及促进T细胞功能耗竭等综合机制,诱导肿瘤微环境中负性免疫应答,抑制了免疫反应,从而发生免疫逃逸。因此Tim-3可能是介导肿瘤免疫逃逸的机制之一,其可能作为苯白血病发病及预后标志物,未来可能指导苯白血病的治疗。第三部分 Tim-3上调及PI3K/AKT/m TOR信号通路在苯诱导AML中的作用机制研究[研究目的]本研究第二部分提示苯的血液毒性可能通过巨噬细胞极化、减少促炎细胞因子分泌、促进抗炎细胞因子释放,使巨噬细胞表型和功能发生改变等上调Tim-3的表达,诱导机体免疫系统逐渐产生免疫抑制,发生肿瘤免疫逃逸,增加了白血病罹患性。那么Tim-3上调在苯诱导白血病的过程中发挥了什么作用?它可能与哪些因素有关?研究发现,Tim-3在人急性髓系白血病(AML)细胞中高度表达,通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路触发生长因子样效应,并通过激活HIF-1信号通路促进缺氧诱导的新生血管形成和提高肿瘤细胞糖酵解能力,从而维持肿瘤细胞的生存与增殖。同时多项研究亦证实PI3K/AKT/mTOR信号通路激活后参与巨噬细胞的增殖发育和活化进程,并促进巨噬细胞由M1型向M2型转换。因此本研究首次以苯染毒诱导AML过程中引起单核/巨噬细胞上Tim-3的改变为切入点,进一步探讨苯白血病发病中Tim-3与PI3K/AKT/mTOR信号通路之间的调控关系,同时也对TGF-β/Smad通路蛋白进行了检测。从Tim-3介导的肿瘤相关巨噬细胞极化、逃脱免疫监视进而促进苯白血病发病的作用机制角度出发,进一步为Tim-3及PI3K/AKT/mTOR信号通路作为苯所致白血病免疫治疗的潜在靶点提供理论依据。[研究方法]1.分别对染毒模型组与对照组实验动物进行免疫组化检测骨髓组织PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达;2.分别对染毒模型组与对照组实验动物进行免疫荧光法检测骨髓巨噬细胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白的表达;3.分别对染毒模型组与对照组实验动物进行免疫组化检测骨髓组织TGF-β1、Smad3蛋白的表达。[研究结果]1.PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表达(1)免疫组化法检测小鼠股骨骨髓组织PI3K/AKT/mTOR蛋白的表达。检测结果显示,与对照组相比,染毒模型组小鼠骨髓组织中PI3K、AKT、mTOR蛋白表达水平均明显增高(p<0.05)。(2)免疫荧光检测小鼠股骨骨髓巨噬细胞p-PI3K、p-AKTP、p-mTOR蛋白的表达。检测结果显示,与对照组相比,染毒模型组小鼠骨髓巨噬细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达水平均明显升高。2.TGF-β/Smad通路蛋白的表达免疫组化法检测结果显示,与对照组相比,染毒模型组小鼠骨髓组织中TGF-β1表达水平明显增高(p<0.05)。与对照组相比,染毒模型组小鼠骨髓组织Smad3表达水平明显升高(p<0.05)。[研究结论]本实验在前期工作基础上进一步研究Tim-3调控在苯诱导AML过程中对肿瘤巨噬细胞免疫逃逸功能的影响,进而探索验证了 Tim-3上调,骨髓组织巨噬细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达增高,因此该信号通路蛋白可能参与了苯染毒过程中巨噬细胞的活化进程,促进巨噬细胞由M1型向M2型极化从而诱导AML。同时研究显示染毒模型组小鼠骨髓组织TGF-β/Smad通路蛋白表达亦明显升高,因此该信号蛋白亦可能共同参与了苯白血病的发病过程。该结果为苯所致白血病的免疫治疗探寻有效靶点,揭示苯染毒诱导AML中Tim-3表达上游/下游相关的关键信号分子及其功能调控网络奠定了基础。