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第一部分mi R-193a-5p在食管癌组织中的表达及其生物信息学分析目的:应用生物信息学技术以及临床样本分析微RNA(mi RNA)-193a-5p在食管癌中的生物信息学作用、表达及其表达水平与食管癌患者临床病理参数之间的相关性。材料与方法:1.从美国国立生物技术信息中心基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)检索获得4个mi RNA测序数据(GSE59856、GSE59973、GSE97049和GSE114110)以及2个m RNA测序数据(GSE17351和GSE20347),利用R语言根据平台信息进行探针注释及标准化处理,并分析其中差异表达的mi RNA和m RNA。2.应用mi RNA靶基因在线预测网站Targetscan和mi Rwalk的预测结果和2个m RNA芯片测序数据的差异性表达基因取交集,以至少在三组数据集中存在的基因作为mi R-193a-5p的候选靶基因。3.利用STRING数据库进行mi R-193a-5p候选靶基因蛋白互作网络的构建。应用DAVID数据库和R包Clusterprofile对所获得靶基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析。4.应用实时荧光定量反转录多聚核苷酸酶链式反应(Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)的方法检测mi R-193a-5p在42例缺锌地区食管癌及相应癌旁组织中的表达水平,并分析其表达水平与食管癌患者临床病理参数之间的相关性。5.绘制工作特征曲线(ROC)分析mi R-193a-5p的表达水平在食管癌诊断中的意义。6.在线数据库分析mi R-193a-5p与食管癌患者生存之间的相关性。7.统计学方法:所有数据采用SPSS21.0和R 3.6.1软件进行统计学分析,计量资料采用t检验或单因素方差分析,计数资料采用χ2或校正χ2检验。结果:1.mi RNA芯片分析发现mi R-193a-5p在食管癌组织中的表达水平显著低于正常组织。2.通过mi RNA靶基因在线预测网站以及2个m RNA芯片测序数据的差异性表达基因分析结果,以及利用蛋白互作网络分析最终确定了BUB1、STIL和KIF14等13个基因作为mi R-193a-5p的主要靶基因。3.功能富集分析发现,mi R-193a-5p主要参与细胞外基质组成、核分裂、细胞器裂变和影响金属内肽酶活性等生物学过程;主要参与包括白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)、转录失调、细胞周期以及核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)等信号通路而发挥作用。4.mi R-193a-5p在42例缺锌地区食管癌组织中的表达水平(0.446±0.028)显著低于相应癌旁组织(0.641±0.033)(P<0.01)。且mi R-193a-5p的表达水平与食管癌患者的淋巴结转移和TNM分期显著相关(P<0.05)。5.ROC分析发现mi R-193a-5p鉴别食管癌及癌旁的曲线下面积为0.759(P<0.01)。6.KM生存分析显示食管癌患者中,mi R-193a-5p的表达水平与食管癌患者的预后无显著相关性(P>0.05)。第二部分mi R-193a-5p对锌缺乏地区食管癌细胞生物学特性的影响及其机制研究目的:Zn(锌)稳态在食管癌的发生发展中起着重要的作用,而ZIP5是重要的锌转运蛋白,前期研究发现ZIP5在食管癌的发生发展中发挥着重要的作用,且mi RNAs是缺Zn影响食管癌发生发展的重要途径,因此,本部分主要分析缺锌时,mi R-193a-5p调控ZIP5的表达促进食管癌发生的机制研究,以期为缺锌地区食管癌的诊疗提供参考。材料与方法:1.应用q RT-PCR方法检测6种食管癌细胞系(Eca109、KYSE170、KYSE150、KYSE9706、TE1和TE13)和永生化食管上皮细胞系NE1中mi R-193a-5p的表达水平。2.应用转染质粒mi R-193a-5p mimics和mi R-193a-5p inhibitor分别构建过/低表达mi R-193a-5p的食管癌细胞系,并通过q RT-PCR检测转染效率。3.分别应用MTS、克隆形成实验、划痕实验、Transwell小室侵袭实验及流式细胞术分别检测敲低和过表达mi R-193a-5p对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期的影响。4.低锌培养食管癌细胞系下,q RT-PCR检测mi R-193a-5p的表达水平变化。5.mi R-193a-5p表达上下调之后,采用q RT-PCR和Western blot检测ZIP5 m RNA和蛋白水平表达情况的变化。6.应用免疫荧光素酶实验验证mi R-193a-5p与ZIP5间的关系。7.采用q RT-PCR和Western blot分别检测敲低和过表达mi R-193a-5p对食管癌细胞EMT相关基因在m RNA和蛋白水平表达情况的影响。结果:1.mi R-193a-5p在6种食管癌细胞系中的相对表达量分别为:Eca109(0.46±0.03),KYSE150(0.31±0.02),KYSE170(0.34±0.02),KYSE9706(0.46±0.03)和TE1(0.37±0.03)均低于永生化食管上皮细胞NE1(0.63±0.03),差异具有统计学意义(P<0.05)。2.q RT-PCR检测低/过表达mi R-193a-5p食管癌细胞显示:转染组细胞中mi R-193a-5p的相对表达量均低/高于NC组和未处理组细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。3.低/过表达mi R-193a-5p对食管癌细胞增殖能力的影响:MTS和克隆形成实验结果显示,敲低mi R-193a-5p显著促进了KYSE150和KYSE170的体外增殖能力(P<0.05);过表达mi R-193a-5p显著抑制了Eca109和KYSE9706的体外增殖能力(P<0.05)4.低/过表达mi R-193a-5p对食管癌细胞迁移能力的影响:划痕实验结果显示:敲低mi R-193a-5p基因促进了食管癌细胞系Eca109和KYSE9706的迁移能力(P<0.05);过表达mi R-193a-5p基因明显抑制了食管癌细胞系KYSE150和KYSE170的迁移能力(P<0.05)。5.低/过表达mi R-193a-5p对食管癌细胞侵袭能力的影响:Transwell实验分析发现,敲低mi R-193a-5p后可以促进食管癌细胞系Eca109和KYSE9706的体外侵袭能力(P<0.05);过表达mi R-193a-5p后抑制食管癌细胞系KYSE150和KYSE170的体外侵袭能力(P<0.05)。6.低/过表达mi R-193a-5p对食管癌细胞周期的影响:流式细胞术结果显示:下调mi R-193a-5p基因可以通过促进细胞在G0/G1和G2/M期的分裂以及阻滞S期而影响食管癌细胞系Eca109和KYSE9706的细胞周期(P<0.05)。过表达mi R-193a-5p基因可以通过诱导细胞阻滞在G0/G1期和缩短S期而影响食管癌细胞系KYSE150和KYSE170的细胞周期(P<0.05)。7.低锌培养食管癌细胞系,q RT-PCR检测结果发现在一定范围内,随着TPEN浓度增加,mi R-193a-5p的表达水平显著降低。8.q RT-PCR和Western blot结果表明:敲低mi R-193a-5p基因可以促进ZIP5的表达;高表达mi R-193a-5p基因可以抑制ZIP5的表达。9.免疫荧光素酶实验显示mi R-193a-5p与ZIP5直接结合并调控其表达。10.q RT-PCR和Western blot结果表明:不论在m RNA和蛋白水平,过表达mi R-193a-5p基因可以抑制N-cadherin和Vimentin的表达,而促进E-cadherin的表达(P<0.05);低表达mi R-193a-5p基因可以促进N-cadherin和Vimentin的表达,而抑制E-cadherin的表达(P<0.05)。结论:1.mi R-193a-5p在食管癌组织和细胞系中的表达水平降低,且其表达水平与食管癌患者的淋巴结转移和TNM分期相关。2.mi R-193a-5p在鉴别食管癌组织和癌旁正常组织的ROC曲线下面积为0.759,提示其可以作为食管癌的诊断标志物。3.mi R-193a-5p的异常表达显著影响食管癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力以及细胞周期,提示其在食管癌中作为抑癌基因而发挥作用。4.mi R-193a-5p的表达水平与Zn浓度有关,且ZIP5是mi R-193a-5p的直接靶标。5.mi R-193a-5p的表达水平可显著影响EMT相关分子的表达,且低锌条件下mi R-193a-5p可能通过靶向ZIP5调节EMT过程而作用于食管癌的发展。