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胞内菌能在宿主细胞内存活和繁殖,并通过宿主细胞的迁移导致胞内菌感染的扩散。结核分枝杆菌、伤寒沙门菌、志贺菌和李斯特菌等均属于胞内菌[1,2]。这些细菌对于人类健康造成很大的危害。每年约有上千万人感染胞内菌,其中有超过两百万人死于胞内菌感染疾病。已有文献报道发现某些胞内菌感染时能够导致宿主细胞内Rab蛋白表达的变化,Rab蛋白控制着胞内吞噬体的成熟过程[3]。如结核分枝杆菌感染后细胞内Rab10、Rab20和Rab32均上调[4,5]。而且Rab蛋白在自噬体形成过程中也有重要的调控作用[6]。目前已证实Rab32在伤寒沙门菌和麻风分枝杆菌感染中具有重要作用[7,8]。我们的前期结果证实,DC2.4细胞中Rab32缺失时,李斯特菌感染后细胞载菌量较对照组明显增加。李斯特菌是一种典型的胞内菌,能够侵入吞噬细胞和非吞噬细胞[9,10]。宿主细胞能够识别病原体,吞噬细菌形成吞噬体,最后形成吞噬溶酶体降解细菌[11,12]。当吞噬体内pH值下降时李斯特菌分泌李斯特菌溶血素(listeriolysin O,LLO),破坏吞噬体膜导致李斯特菌进入胞浆[13],胞浆内的李斯特菌和含菌囊泡被分离膜包裹形成自噬体来降解细菌。已有文献报道李斯特菌分泌的ActA蛋白能帮助细菌逃避自噬[14]。为了阐明Rab32在树突状细胞影响李斯特菌感染的作用和机制,我们构建了树突状细胞条件敲除Rab32基因的小鼠、慢病毒转染Rab32基因或LC3基因的细胞,以及RNA干扰Atg5基因的细胞,通过动物和细胞载菌量实验,激光共聚焦显微镜技术和高内涵图像分析系统,系统地研究了Rab32在树突状细胞感染李斯特菌中的作用。本研究的主要内容如下:1、通过基因敲除技术构建树突状细胞条件敲除Rab32基因的小鼠,我们能够观察树突状细胞中Rab32对于李斯特菌感染的影响。结果显示树突状细胞条件敲除Rab32基因小鼠生长发育未见异常。而且流式细胞术结果表明小鼠脾脏和外周淋巴结中树突状细胞的数量和表型未有明显变化。通过尾静脉注射制备李斯特菌系统感染模型,我们能够观察树突状细胞中Rab32对于李斯特菌增殖的影响。组织载菌量实验发现李斯特菌感染3天后,树突状细胞条件敲除Rab32基因小鼠脾脏和肝脏组织细菌增殖明显上升。实验证实Rab32影响了李斯特菌在小鼠组织中的增殖。2、通过体外诱导培养骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)进行细胞载菌量实验,我们能够明确Rab32对于李斯特菌在树突状细胞中增殖的影响。结果发现李斯特菌感染后,Rab32缺失BMDC载菌量明显上升,以5h时为甚。为了明确树突状细胞内Rab32与李斯特菌的相互作用,我们构建了EYFP-Rab32过表达的DC2.4细胞,通过高内涵图像分析系统分析RFP表达李斯特菌感染的细胞,发现Rab32囊泡能够包裹细菌,且李斯特菌逃逸后Rab32仍能包裹细菌。接着,通过体外诱导培养骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs)和腹膜巨噬细胞(peritoneal macrophages)的细胞载菌量实验,以及过表达EYFP-Rab32的RAW264.7细胞的影像学实验,我们进一步明确Rab32抗菌作用在吞噬细胞中普遍存在。3、为了研究Rab32囊泡在李斯特菌感染的哪些阶段发挥作用,我们利用△hly李斯特菌不能从吞噬体中逃逸的特性和△act A李斯特菌不能迁移的特性,通过BMDC细胞载菌量实验发现Rab32缺失导致两种细菌增殖明显上升,Rab32在李斯特菌感染的多个阶段发挥抑菌作用。为了直观地监测Rab32囊泡在李斯特菌感染过程中的作用,我们采用激光共聚焦显微镜进行荧光实时影像观察,发现无论细菌是否逃逸,Rab32囊泡均能包裹细菌,且Rab32囊泡内的细菌不能增殖。为了了解Rab32囊泡与自噬之间的关系,我们采用RNA干扰Atg5基因和高内涵图像分析技术进行实验,结果发现Atg5缺失细胞内Rab32囊泡数量并未发生明显变化。为了进一步了解自噬对于Rab32囊泡功能的影响,我们进行了细胞载菌量实验,结果显示干扰Atg5基因后,Rab32缺失BMDC中李斯特菌增殖明显更多。高内涵图像分析结果显示虽然Rab32囊泡与LC3存在共定位,但数量很少;而且Rab32与LC3双阳性囊泡的变化趋势与Rab32囊泡不同,感染2h的细胞内Rab32囊泡最少,而双阳性囊泡最多。结果表明Rab32囊泡并不完全依赖于自噬发挥作用。结论本研究首次发现了Rab32具有限制李斯特菌增殖的作用,且Rab32作用并不仅仅存在于树突状细胞,而是吞噬细胞中普遍存在的机制。Rab32在李斯特菌感染的多个阶段,甚至在李斯特菌逃逸后仍能发挥抑菌作用。Rab32通过形成囊泡参与了吞噬细胞内抑制李斯特菌增殖的作用。综上所述,Rab32是一种存在于吞噬细胞的,不依赖于自噬的,新颖的膜性抗菌机制。