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研究目的人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodificiency Viruse 1,HIV-1)感染后,联合抗逆转录病毒疗法(combined antiretroviral therapy,c ART)可以有效地抑制病毒复制。然而,由于病毒整合在被感染细胞中并形成一个稳定的潜伏感染储存库,被感染者一旦停止c ART治疗病毒血症即在短时间内再爆发,这构成了治愈HIV-1感染的主要障碍。当前的研究热点是通过特异性的潜伏感染逆转药物(latency-reversing agents,LRAs)激活潜伏感染的病毒,进而药物治疗或诱导机体免疫系统杀灭被感染细胞。这种干预策略被称为“shock and kill”。然而,HIV-1可以迅速的发生突变以逃避免疫识别。研究显示在经过c ART治疗的感染者当中,即使成功激活了其潜伏感染,体内的CD8+T淋巴细胞由于缺乏对HIV-1有效的免疫应答,所以不能完全清除被感染的细胞。因此,在“shock and kill”策略中,为了更好的清除潜伏感染储存库,需要在被感染者体内重建强有力的免疫监控机能。近年来,由于具有高亲和力、TCR(T cell receptor)非依赖和MHC(major histocompatibility complex)非限制等特点,嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的免疫细胞疗法成为了杀伤肿瘤细胞的全新途径。CAR是由抗体靶向区域与T细胞激活胞内信号区融合而成,从而赋予细胞特异性抗原识别能力。通过在患者自体免疫细胞中表达识别肿瘤天然抗原的CAR分子并对进行过继免疫回输,可以特异性的靶向杀伤患者体内的肿瘤细胞。CAR-T细胞疗法已在白血病和淋巴瘤的临床治疗中证明了有效性,并且获得了令人鼓舞的成功。该策略也可应用于抗病毒治疗,包括HIV-1、HBV(hepatitis B virus)和HCV(hepatitis C virus)等病毒感染的治疗。已有的研究通过将HIV-1特异性的单链抗体的可变区(single-chain variable fragment,sc Fv))或天然的CD4分子中的抗原识别/结合区域连接到CD8+T淋巴细胞受体的胞内T细胞激活区域产生了HIV-1特异性的CAR-T细胞,该细胞可以杀伤表达HIV-1包膜蛋白的细胞。然而,该方法是否能够清除经过c ART治疗的HIV-1感染者的潜伏感染储存库还不得而知。研究方法在本文中,通过分子克隆将HIV-1广谱中和抗体VRC01来源的sc Fv序列和三种不同的CAR分子胞内段序列连接在一起,分别作为胞外和胞内结构,随后分别转导至原代CD8+T淋巴细胞中。我们通过对细胞毒性检测筛选得到最有效的CAR模块(VC-CAR)并且比较了VC-CAR和已报道的CD4-CAR的功能。然后,通过将VC-CAR-T细胞与两株表达HIV-1包膜蛋白的细胞系或野生型HIV-1感染的CD4+T淋巴细胞分别进行共培养,检测其细胞因子分泌和特异性的细胞杀伤功能。利用体外感染模型模拟撤除抗逆转录病毒药物的体内病毒血症反弹过程,检测VC-CAR-T细胞的抑制病毒血症反弹的作用。最后,我们在VC-CAR-T细胞存在的条件下进行了病毒增殖实验(Viral outgrowth assay,VOA),以确定VC-CAR-T细胞是否可以在经过c ART治疗的感染者样本中清除HIV-1潜伏感染。研究结果本研究中全新改造的VC-CAR-T细胞与表达gp120的细胞系或HIV-1感染的CD4+T细胞进行共培养,VC-CAR-T细胞可以被特异性激活并大量分泌细胞毒性相关的细胞因子(包括IFN-γ、IL-2和Granzyme B),进而强有力地介导表达gp120的细胞系或HIV-1感染的CD4+T淋巴细胞的裂解。并且相比已报道的CD4-CAR-T细胞,VC-CAR-T细胞介导表达gp120细胞系的裂解效果更加明显。体外HIV-1感染CD4+T淋巴细胞的模型中,通过抗病毒的药物组合(逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)的施加和撤除,模拟了临床实践中c ART终止的情况,并且证明了抗病毒的化合物撤除后,VC-CAR-T细胞可以显著抑制HIV-1的反弹。更重要的是,在经过c ART治疗的HIV-1感染者样本当中,在利用多种LRA组合重新激活其HIV-1潜伏感染储存库后,VC-CAR-T细胞能够强有力地持续抑制HIV-1的复制和产生,有效清除重新激活的HIV-1潜伏感染的CD4+T淋巴细胞。研究结论我们的结果表明,在功能性治愈HIV-1感染的实验探索和临床实践过程当中,由于VC-CAR-T细胞诸多特点和优势,可以清除c ART治疗HIV-1感染者样本中被激活的潜伏感染储存库,VC-CAR-T细胞疗法是一条适合的候选途径,值得进一步的理论研究和技术优化。