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目的:胃癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在所有恶性肿瘤中居第五位,致死率居第三位,其5年生存率仅为20%-40%。尽管外科手术、各种药物及放射治疗在胃癌中的应用提高了患者的生存率,降低了复发转移的风险,但胃癌整体治疗效果还不甚满意。探索胃癌发生发展中的关键分子及其相关机制,能够为胃癌的防治提供新方向,将有助于改善胃癌的治疗效果。G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)是体内最大的膜蛋白家族之一,其位于细胞膜表面,可通过与胞内的G蛋白偶联,将胞外的各种刺激及信号传递至细胞内,参与到细胞的增殖、分化、代谢、迁移、分泌、生长发育、炎症与免疫等多种生理活动。目前研究发现大量的G蛋白偶联受体家族成员参与了心脑血管疾病、神经系统疾病、肿瘤、过敏性疾病、炎症反应等多种疾病,同时发现许多G蛋白偶联受体家族成员与增殖、侵袭、迁移等恶性肿瘤生物学行为密切相关。神经肽S受体1(Neuropeptide S receptor1,NPSR1)是近年发现的G蛋白偶联受体家族成员之一,因神经肽S(Neuropeptide S,NPS)是其内源性配体肽,故命名为神经肽S受体1(Neuropeptide S receptor1,NPSR1)。NPSR1在人体内表达分布广泛,在脑组织、胸腺、肺组织、支气管、胃肠道组织(食管、胃、小肠、结肠)以及外周血单核巨噬细胞及嗜酸性粒细胞中均有表达,因此既往研究报道NPSR1参与调节人体内神经精神活动及免疫反应等生理活动。目前NPSR1在肿瘤中的研究较少,既往研究发现NPSR1在神经内分泌肿瘤中广泛表达,可作为神经内分泌肿瘤潜在诊断标志物,但其作用及相关机制尚不明确,并且NPSR1在其他恶性肿瘤组织中的表达情况及作用仍不清楚。此外有研究发现NPSR1在其配体NPS的刺激下,可促进肠癌细胞的增殖。这提示NPSR1在恶性肿瘤中可能存在一定的作。生物信息学分析发现NPSR1在胃癌组织中存在显著差异表达,并与部分临床病理资料相关。基于以上考虑,本研究目的在于明确NPSR1在胃癌中的表达情况,并探索NPSR1对胃癌生物学行为的影响及其潜在的作用机制。研究方法:我们利用TCGA数据库中胃癌表达矩阵比较癌组织与正常组织中NPSR1表达差异,并探讨NPSR1与临床病理资料间的关系。选取本中心256例胃癌患者石蜡标本进行免疫组化染色,分析NPSR1在胃癌组织及癌旁正常组织中表达情况,并探讨同其与胃癌临床病理资料及预后的关系。通过Western Blot检测胃癌细胞株AGS、SGC-7901、MGC-803和人正常胃粘膜细胞株GES-1中NPSR1表达。其后利用慢病毒转染构建稳定沉默NPSR1的SGC-7901、MGC-803细胞株,同时得到阴性对照细胞株,Western Blot及实时荧光定量PCR检测转染效率。稳定沉默后,我们通过Transwell小室实验检测稳定沉默细胞株与阴性对照细胞株间侵袭、迁移能力,利用CCK-8实验与集落形成实验检测细胞间增殖能力,同时流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡情况。为了进一步解释NPSR1对于胃癌生物学行为影响的机制。我们通过Western Blot检测NPSR1沉默对MAPK信号通路中ERK及其磷酸化的影响,并利用Western Blot以及real time PCR检测NPSR1沉默后,其下游靶基因CCND1及CDK4的表达变化。两组资料间比较采取t检验、秩和检验或卡方检验。Kaplan-Meier方法分析患者的生存情况,Log-rank检验比较生存曲线间的差异。Cox比例风险回归模型筛选预后的独立危险因素。所有统计分析采用双侧检验,认定P<0.05为具有统计学意义。所有统计分析及图像制作均采用SPSS 21.0,R软件(3.5.1)以及GraphPad Prism6.0软件。结果:研究结果发现在TCGA胃癌数据库中,NPSR1 mRNA水平的表达量显著高于癌旁正常组织,在配对及非配对样本中均存在显著差异(P<0.001),比较临床病理因素间差异发现NPSR1与进展期的T分期、TNM及肿瘤分级相关(P<0.05)。免疫组化检测证实,NPSR1在胃癌组织中高表达,在癌组织中阳性表达率显著高于配对正常组织(P<0.001)。同时NPSR1高表达与进展的T分期、N分期、TNM分期相关,Kaplan-Meier方法比较预后发现NPSR1高表达患者生存率预后显著低于低表达患者,并且是预后的独立危险因素。我们构建了稳定沉默NPSR1的MGC-803及SGC-7901细胞株,Western blot及实时荧光定量PCR检测转染效率满意。 Transwell小室实验对各组细胞的迁移、侵袭能力进行检测,结果显示:与阴性对照组细胞相比,NPSR1沉默组细胞迁移至下室的数量显著减少(P<0.05),说明沉默NPSR1可以显著抑制胃癌细胞的侵袭、迁移能力。CCK-8实验及克隆形成实验对各组细胞的增殖能力进行检测。结果显示:相比于阴性对照组细胞,NPSR1沉默后细胞的增殖能力与集落形成数量显著降低(P<0.05),说明沉默NPSR1可以显著抑制胃癌细胞体外增殖能力。流式细胞技术检测细胞周期的变化,结果显示:相比于阴性对照组细胞,NPSR1沉默后,G0/1期细胞比例上升(P<0.05),G2/M期细胞比例下降(P<0.05),说明沉默NPSR1可以影响细胞周期,使细胞周期阻滞于G0/1期。比较两组细胞的凋亡情况发现,NPSR1沉默组与阴性对照组细胞凋亡比例无显著差异(P>0.05),说明NPSR1对胃癌细胞凋亡无显著影响。进一步我们利用Western Blot技术检测NPSR1沉默后,MAPK信号通路中ERK及磷酸化ERK的变化情况,结果显示当NPSR1沉默后磷酸化ERK的显著减少,而ERK总量的表达并无明显改变。此后我们检测MAPK/ERK信号通路的下游基因CCND1及CDK4的表达情况,结果发现NPSR1沉默后,CCND1及CDK4的表达也显著降低,提示NPSR1可能通过调节MAPK/ERK信号通路,进而影响CCND1及CDK4的表达,影响胃癌细胞增殖及细胞周期。结论:NPSR1在胃癌组中呈现显著的高表达,并与T分期、N分期、TNM分期临床病理资料相关。NPSR1高表达患者预后差于低表达患者,是预后的独立危险因素之一。NPSR1沉默后可显著抑制胃癌细胞的侵袭、迁移、增殖能力,并可影响细胞周期的变化,但不影响胃癌细胞的凋亡。NPSR1可通过调节MPAK/ERK信号通路,进而影响CCND1及CDK4的表达而发挥作用。