研究背景乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤。依据其是否表达雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2,乳腺癌被分为三阴性乳腺癌(TNBC)以及非三阴性乳腺癌(non-TNBC)两大类。与非三阴性乳腺癌相比,三阴性乳腺癌侵袭性更强,并更易发生早期转移。目前针对乳腺癌的靶向治疗主要依赖肿瘤细胞表达的雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2,而由于三阴性乳腺癌不表达这三类受体,严重影响了其早期诊断、治疗及预后判断。目前临床常用的非侵入性诊断三阴性乳腺癌的手段主要包括影像学检查及血清肿瘤标记物检测等,其在早期诊断三阴性乳腺癌均存在明显不足和局限性。因此,研究发现有望用于非侵入性早期诊断与监测的高特异性、高灵敏度的三阴性乳腺癌分子标志物,已经成为亟待解决的问题。核医学分子影像是一种基于代谢和功能异常的非侵入性显像方法。与传统的影像学方法CT和MRI相比,在肿瘤的诊断和分期方面,核医学分子影像更适合检测和量化肿瘤靶向分子。目前,18F-FDG(氟-18-脱氧二磷酸葡萄糖)PET/CT(正电子发射断层扫描/计算机断层扫描)已广泛用于临床肿瘤诊断、分期及疗效评估。但是,18F-FDG是一种非特异性核素分子探针,多种因素可影响诊断结果,存在假阴性和假阳性。因此寻找更好的分子靶点对于临床肿瘤诊断和治疗至关重要。分子显像可基于功能和代谢的变化及早显示肿瘤,在肿瘤的早期诊断和治疗中展现出巨大的潜力和良好的应用前景。近来研究表明多种分子参与肿瘤的发展和预后,如CCAT2(一种长的非编码RNA,与转移和预后有关)和三种miRNA(膀胱癌患者的潜在预后生物标志物)等。Toll样受体(Toll Like Receptor)是膜结合蛋白,最初主要发现在免疫细胞表达,如单核细胞/巨噬细胞、血管内皮细胞等,也可在其它类型的细胞中表达,如肿瘤细胞。TLR家族不同成员(TLR1-13)识别不同的病原体相关分子模式(PAMP)。作为TLR家族成员,TLR5特异性识别鞭毛蛋白,鞭毛蛋白是TLR家族中唯一的蛋白质配体。最近研究发现,TLR5在多种肿瘤中高表达,例如卵巢癌,胃癌和结肠癌,激活TLR5通路可显著抑制肿瘤的生长。更重要的是,研究发现TLR5在三阴性乳腺癌中高表达,且与肿瘤进展密切相关。鉴于TLR5表达与肿瘤进展相关,本文科学假设是TLR5有可能作为监测三阴性乳腺癌的分子靶点。本研究选择三阴性乳腺癌细胞系4T1,研究TLR5是否可作为非侵入性监测三阴性乳腺癌的分子靶点及其相关分子机理。本论文通过慢病毒稳定转染技术,成功构建了带有荧光素标签的TLR5表达降低的TLR5-4T1细胞和TLR5表达正常的TLR5+4T1细胞系;成功制备125I-anti-TLR5mAb及同种型对照组125I-IgG;成功构建4T1荷瘤裸鼠模型。通过两大部分,体内和体外实验,分别研究了基于核素和荧光显像评价以TLR5为靶点监测三阴性乳腺癌及TLR5表达对三阴性乳腺癌侵袭转移的影响及分子机理。本论文旨在为监测三阴性乳腺癌寻找高选择性靶分子,为早期非侵入性诊断三阴性乳腺癌提供新的策略。第一部分基于核素和荧光显像评价TLR5为靶点监测三阴性乳腺癌的意义研究方法1.通过慢病毒 shRNA 转染,构建 TLR5-4T1(GFP+)和 TLR5+4T1(GFP+)细胞系2.125I-anti-TLR5 mAb和125I-IgG制备lodogen法标记制备放射性核素分子探针125I-anti-TLR5 mAb和同种型对照125I-lgG。使用PD-10凝胶色谱柱进行洗脱纯化,计算125I-anti-TLR5 mAb和125I-IgG的标记率和放射性比活度。采用纸层析法测定125I-anti-TLR5 mAb和125I-IgG的放化纯及稳定性。3.Real-time quantitative PCR(qPCR)和 Western blot 检测 TLR5-和 TLR5+4T1细胞TLR5表达状况常规无菌培养TLR5-和TLR5+4T1细胞。利用qPCR检测TLR5-和TLR5+4T1 细胞的 TLR5 mRNA 表达状况;Western blot 分析 TLR5-和 TLR5+4T1细胞的TLR5蛋白表达状况。4.标记物体外细胞结合实验将生长状态良好的TLR5-和TLR5+4T1细胞分别接种于24孔板,每孔5x105个细胞,按浓度梯度(1～30nM)加入标记物,2h后,PBS洗涤,测量各组放射性计数(cpm),对比分析TLR5-和TLR5+4T1细胞对125I-anti-TLR5 mAb的亲和解离常数(Kd值)和受体结合最大量(Bmax)之间的差异。5.标记物体外细胞结合阻断实验将TLR5+4T1细胞(2×105/孔)接种于24孔板上,同时加入定量125I-anti-TLR5 mAb 或 125I-IgG 及未标记的 anti-TLR5 mAb(0.1、1、10、100、1000 nmol/L)45min后,PBS洗涤,测量放射性计数,分析anti-TLR5 mAb对125I-anti-TLR5 mAb或125I-IgG与TLR5+4T1细胞结合的阻断状况。6.荷瘤裸鼠模型构建及显像6周龄雄性裸鼠左肩接种TLR5-4T1细胞(1×107),右肩接种TLR5+4T1细胞(1×107),分别在接种后第4、6、8、10、12天经尾静脉注射125I-anti-TLR5 mAb或125I-IgG(小鼠提前24h用3%Nal饮水封闭甲状腺)。分别在注射125I-anti-TLR5(0.37 MBq/只)或 125I-IgG(0.37 MBq/只)后 24、48 和 72h 进行全身磷屏自显影显像,并在72h进行荧光显像。对于anti-TLR5 mAb阻断组,在注射125I-anti-TLR5 mAb之前30min,预先通过尾静脉注射过量未标记的anti-TLR5 mAb,100μg/只。7.生物学分布磷屏显像及荧光显像结束后,每组随机取5只小鼠,取主要器官(心、肝、肾、骨、肺、小肠、甲状腺、脾等)、肿瘤及对侧肌肉组织,称重并测定其cpm,计算%ID/g值。8.肿瘤H&E和TLR5免疫组织化学染色随机选取4T1乳腺癌模型鼠,处死后取出肿瘤组织,4%多聚甲醛固定并制备成石蜡切片,进行H＆E染色,并利用抗TLR5抗体进行免疫组化染色。研究结果1.成功构建TLR5表达下调的TLR5-4T1细胞系及TLR5表达正常的TLR5+4T1细胞系。2.成功制备放射性核素探针125I-anti-TLR5 mAb,标记率为94.55%,放射性比活度为925.25MBq/mg,放化纯为95.44%;同种型对照125I-IgG标记率为92.14%,放射性比活度为 915.58MBq/mg,放化纯为 92.47%。125I-anti-TLR5 mAb和125I-IgG均具有较好的稳定性,至72h仍维持在95%以上。3.细胞结合实验结果显示,TLR5-和TLR5+4T1细胞结合125I-anti-TLR5 mAb的Kd值分别为6.463nmol/L和6.069nmol/L,TLR5+4T1细胞亲和力略高于TLR5-4T1 细胞;TLR5-和 TLR5+4T1 细胞的 Bmax 值是 2811 cpm/5 × 105 细胞和6245 cpm/5×105细胞,TLR5+4T1细胞的Bmax值明显高于TLR5-4T1细胞。4.结合阻断实验表明,未标记的anti-TLR5 mAb可特异性阻断TLR5+4T1细胞与125I-anti-TLR5 mAb的结合,加入量与阻断率呈正比,但对TLR5+4T1细胞与125I-IgG的结合无影响。5.从接种瘤细胞第6天开始,磷屏自显影显像即可显示TLR5+4T1肿瘤,一直到第14天,显像越来越清晰。而TLR5-4T1肿瘤直到第14天也未能清晰显示。荧光显像证实TLR5+和TLR5-4T1肿瘤随时间大小变化,时间越长,肿瘤体积和质量越大。此外,同一时间点,125I-IgG组和未标记anti-TLR5mAb阻断组的肿瘤也未能清晰显示。6.生物学分布研究结果显示,125I-anti-TLR5 mAb主要通过肝、肾代谢,TLR5+4T1 肿瘤(8.413±0.5270)的 T/NT 比值显著高于 TLR5-4T1 肿瘤(2.489±0.1541),p<0.05。未标记 anti-TLR5 mAb 阻断组中,TLR5+4T1 肿瘤的 T/NT比值仅为1.57±0.13。125I-IgG组中,TLR5+4T1肿瘤的T/NT比值仅为2.023 ±0.2149。7.肿瘤组织病理学切片显示典型肿瘤组织特征;TLR5+4T1肿瘤免疫组化染色阳性率显著高于TLR5-4T1肿瘤,p<0.05,与体外分析所测得的两种乳腺癌细胞系TLR5表达结果一致。第二部分TLR5表达对三阴性乳腺癌侵袭转移的影响及分子机理研究方法1.构建TLR5表达降低和TLR5表达正常的4T1细胞系,方法同第一部分2.CCK-8实验研究TLR5-和TLR5+4T1细胞增殖能力将TLR5-和TLR5+4T1细胞分别铺96孔板,每孔均2×103个细胞,孵育过夜后,用酶标仪分别测0、6、24、36、48h在450nm的吸光度(OD450)。3.流式细胞术分析TLR5-和TLR5+4T1细胞的凋亡状况用0.25%不含EDTA和酚红的胰酶消化TLR5-和TLR5+4T1细胞,离心洗涤后,使用细胞凋亡检测试剂盒,按照说明书处理细胞,过滤后,使用流式仪检测细胞凋亡状况。4.克隆形成实验研究TLR5-和TLR5+4T1细胞成瘤能力将TLR5-和TLR5+4T1细胞分别接种于6孔板,每孔1×103个细胞,每隔3天换1次培养基,共培养14天。然后弃培养基,用PBS洗涤后,用0.005%结晶紫染色液染色20min,PBS洗涤。5.划痕实验研究TLR5-和TLR5+4T1细胞迁移能力将TLR5-和TLR5+4T1细胞分别接种于6孔板,每孔5×105个细胞,过夜后,用10μL枪头划线,PBS清洗后拍照为Oh,然后更换为无血清培养基。24h后,PBS洗涤,然后拍照。6.Transwell实验研究TLR5-和TLR5+4T1细胞侵袭能力在Transwell板上室,铺100μL浓度为300μg/mL的基质胶,待胶凝固后,上室分别接种8×103个TLR5-或TLR5+4T1细胞,上室使用的是无血清培养基。下室使用正常培养基。24h后,用棉棒擦去小室内面基质胶和细胞,甲醇固定后,结晶紫染色,显微镜下观察并拍照。7.肺转移实验研究TLR5-和TLR5+4T1细胞在裸鼠体内转移能力选取6周龄雄性裸鼠,通过尾静脉分别注射TLR5-或TLR5+4T1细胞,每只小鼠1×106个细胞。3周后,处死小鼠并解剖出完整肺,称重后,荧光显像。8.构建4T1荷瘤鼠模型并分析肿瘤大小随时间的变化状况6周龄雄性裸鼠左肩接种TLR5-4T1细胞(1×107),右肩接种TLR5+4T1细胞(1×107),分别在第接种后第6、8、10、12、14天处死并解剖出完整肿瘤,称重,测量大小。9.qPCR和Western blot验证TLR5下调引起的细胞信号通路改变用qPCR和Western blot分别在基因和蛋白水平检测TLR5下调后的EMT通路变化及相互关系。研究结果1.CCK-8实验中,在各个时间点,TLR5-4T1细胞的吸光度都高于TLR5+4T1细胞。表明4T1细胞TLR5下调明显促进了细胞增殖;克隆形成实验中,TLR5-4T1细胞的克隆形成率明显高于TLR5+4T1细胞的克隆形成率,表明TLR5下调增强了肿瘤的成瘤性;划痕实验结果显示TLR5-4T1细胞的迁移面积明显大于TLR5+4T1细胞的迁移面积,提示前者转移能力明显高于后者。Transwell实验结果显示TLR5-4T1细胞成功穿膜的细胞数量明显多于TLR5+4T1细胞。以上体外实验结果均表明TLR5-4T1细胞的增殖、侵袭、转移、成瘤能力均明显高于TLR5+4T1细胞,但是TLR5下调对细胞凋亡无明显影响。2.肺转移实验结果显示,与TLR5+4T1细胞注射组相比,TLR5-4T1细胞的肺转移灶更多,其转移能力明显增强。3.荷瘤小鼠模型肿瘤体外检测结果显示,在所测的各个时间点,TLR5-4T1肿瘤的重量和体积都明显高于TLR5+4T1肿瘤。4.TLR5表达下调后,在mRNA和蛋白水平上,E-钙粘蛋白表达减少,N-钙粘蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、TWIST1、TRAF6和SOX2表达升高。TLR5表达下调后,EMT进程加速相关的E-钙粘蛋白表达减少,N-钙粘蛋白、波形蛋白、纤连蛋白表达升高;EMT相关信号通道分子TWIST1、TRAF6和SOX2表达也明显升;TLR5和TRAF6表达呈负相关,而TRAF6和SOX2的表达呈正相关,SOX2高表达加速了 EMT进程。结果提示下调TLR5可通过下调TRAF6-SOX2信号通路促进EMT进程。全文小结1.成功构建TLR5-和TLR5+4T1细胞系。2.制备的125I-anti-TLR5 mAb可与4T1细胞在体外特异性结合;结合能力与4T1细胞TLR5表达量密切正相关。3.TLR5-和TLR5+4T1荷瘤模型小鼠生物学分布与全身磷屏动态自显影显像结果均显示125I-anti-TLR5 mAb特异性靶向4T1肿瘤,肿瘤放射性浓聚与TLR5表达量密切正相关。TLR5+4T1肿瘤在荷瘤后第6天即可见肿瘤显影,而TLR5-4T1肿瘤直到第14天也无法显示肿瘤。荧光显像可与核素显像对肿瘤共定位并清晰显示肿瘤边界。4.TLR5表达下调明显促进了 EMT进程,使4T1细胞的增殖、侵袭及转移能力明显增强。荷瘤鼠肺荧光显像和H＆E染色进一步证实TLR5下调的4T1细胞肺转移及成瘤能力明显增强。结果提示TLR5主要是通过TLR5-TRAF6-SOX2通路调控三阴性乳腺癌4T1细胞活性。创新点1.首次构建了带有荧光素标签的TLR5表达下调的TLR5-4T1细胞系。2.首次将放射性核素探针125I-anti-TLR5 mAb用于三阴性乳腺癌荷瘤裸鼠模型显像,125I-anti-TLR5 mAb可在体内外与4T1细胞特异性结合。125I-anti-TLR5 mAb在荷瘤小鼠模型TLR5表达阳性肿瘤区域特异性浓聚,TLR5作为三阴性乳腺癌的新型分子靶点具有潜在的临床应用前景。3.研究发现TLR5表达下调明显促进三阴性乳腺癌细胞增殖、转移和侵袭,TLR5下调通过TRAF6-SOX2信号通路促进EMT进程。