乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）是一类革兰阳性、过氧化酶阴性、无芽孢、可将生存环境中碳水化合物代谢成乳酸的细菌,多数被视为食品级安全菌（GRAS）。因其具有广泛的益生作用、较为成熟的基因操作平台、自身不含有内毒素以及天然的佐剂作用被视为很有潜力的口服活载体疫苗候选菌株。组成型表达系统可在不需要任何理化因素的诱导下伴随宿主菌自身蛋白的表达一起表达,相比诱导表达系统更加适合用于乳酸菌作为递送外源蛋白活载体疫苗的开发。由嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,AH）和鲤疱疹病毒 2 型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）感染引起的鲫鱼病害给水产养殖业带来重要经济损失,特别是CyHV-2感染目前尚无有效疫苗预防。本研究旨在开发一种利用乳酸菌作为活载体递送两种病原的保护性抗原,为研发预防水产疫病口服疫苗提供理论基础和技术平台。1乳酸菌-大肠杆菌穿梭载体改造及重组乳酸菌生物特性分析pPG612作为一种常见的乳酸菌-大肠杆菌穿梭表达载体,其自身拷贝数低,在重组乳酸菌中生长过程中需要加入木糖作为诱导剂才能表达外源蛋白,限制了该载体作为口服活载体疫苗的研究。为了获得一种能够在不添加诱导剂条件下,其载体上的外源蛋白可随着细菌生长而持续表达的新型乳酸菌-大肠杆菌穿梭表达载体,本研究在pPG612载体基础上,保留载体在乳酸菌-大肠杆菌稳定存在的骨架区,将原有的诱导型表达盒换成组成型表达盒,即将原有的Pxyl启动子更换为PHCE启动子,与此同时在PHCE启动子的下游依次添加T7g10翻译增强子、USP45乳酸乳球菌分泌性信号肽、pET28a载体上紧凑型多克隆酶切位点片段以及T7t、rrnBT1、rrnBT2串联终止子。试验成功构建了 pPG-HCE乳酸菌-大肠杆菌穿梭组成型表达载体。同时对带有改造后载体重组乳酸菌的基本生物特性进行分析,并利用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告基因评价了 pPG-HCE载体对外源蛋白的表达水平。试验结果表明,pPG-HCE载体在没有抗性筛选条件下依旧能够稳定存在;连续传代结果表明,没有出现载体或者目的基因的序列突变,基本不会影响宿主菌的生长;荧光定量PCR和Western blot结果表明,pPG-HCE载体可以成功在宿主菌中转录和翻译目的基因,并且其蛋白表达明显高于pPG612载体。2 CyHV-2病毒粒子纯化及其囊膜蛋白抗原性分析CyHV-2是近年来引起鲫鱼鳃出血病的病原,目前没有稳定的细胞系可用于该病毒分离,给疫苗研制带来困难。本试验对鳃出血病鲫鱼进行CyHV-2感染的PCR鉴定,并在此基础上,通过蔗糖密度梯度离心从发病鲫鱼组织中成功提纯CyHV-2病毒粒子,并制备了鼠抗CyHV-2全病毒血清多抗,间接ELISA检测抗体效价达1:2000。通过对CyHV-2的4种囊膜蛋白（ORF32、ORF81、ORF108、ORF131）进行B细胞表位分析和跨膜结构预测发现,ORF32、ORF131具有多潜在的B细胞表位。以提纯的CyHV-2基因组为模板,分别构建4种蛋白原核表达载体,成功克隆表达2种囊膜蛋白ORF32、ORF131,Western blot证实均能被CyHV-2全病毒抗体识别。相比ORF32而言,ORF131分子量较大,且B细胞表位分布均匀,为后续研究提供了理想的疫苗候选蛋白。利用原核表达纯化的ORF131蛋白免疫小鼠制备血清多抗,抗体效价达1:4000,为ORF131蛋白检测提供了物质基础。3表达Hcp与ORF131蛋白的重组乳酸菌免疫效力分析利用已构建的乳酸菌表达系统,分别表达CyHV-2的ORF131蛋白和嗜水气单胞菌溶血素共调节蛋白（Hcp）,同时通过柔性连接肽连接ORF131和Hcp蛋白以实现两种病原微生物保护性抗原的融合表达。亚细胞定位表明,单独表达的Hcp和ORF131蛋白均可分泌到胞外,而Hcp-Glinker-ORF131融合蛋白培养液上清没有检测到。三种蛋白在细胞破碎上清和沉淀均可检测到。为评价重组乳酸菌对动物机体免疫效力,本试验给模式动物ICR小鼠分别灌胃表达有Hcp、ORF131和Hcp-Glinker-ORF131融合蛋白的重组乳酸乳球菌。通过间接ELISA检测35d、49d各组肠道及粪便的sIgA水平和血液中IgG水平,荧光定量PCR检测各组的血液、脾脏、肠道细胞因子转录水平来评价重组乳酸菌对小鼠机体的免疫效力。间接ELISA结果表明,三株乳酸菌均能很好刺激小鼠机体产生特异性的sIgA和IgG,其中35 d抗体水平高于49 d,各组细胞因子转录水平检测结果基本与抗体检测趋势一致。研究表明,表达保护性抗原的重组乳酸菌可一定程度上刺激机体产生特异性抗体,激发机体的黏膜免疫。综上,本研究在改造乳酸菌表达系统的基础上,成功利用该系统表达了两种病原的保护性抗原,并通过动物免疫试验证实具有良好的免疫效果,为研发水生动物口服疫苗提供了奠定了基础。