目的:肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种致命性的神经退行性疾病。它是运动神经元病(MND)中最常见的类型,特点为上运动神经元与下运动神经元同时受累,主要累及脊髓前角细胞、小脑运动神经元等并导致神经元细胞变性死亡[1]。主要临床表现为进行性加重的骨骼肌无力与萎缩等,60%以上患者在起病3年内死亡,约有10%生存期可达8年以上[2]。ALS中约有5-10%为家族性ALS(familial ALS,f ALS)[3],其余患者为散发性ALS(sporadic ALS,s ALS),无家族史。其中大约有f ALS中的10-20%和s ALS中的4%都和铜锌超氧化物歧化酶.(Cu/Znsuperoxide dismutase 1,SODl)的突变有关[4,5]。ALS的发病机制到目前为止还尚未完全明确,在过去的相关研究中研究人员根据各方面的研究成果提出了很多种假说,包括谷氨酸兴奋毒性、氧化应激、蛋白的异常折叠和聚集、线粒体损伤、自身免疫机制以及营养因子缺乏等[6,7]。成纤维生长因子2(Fibroblast.growth.factor 2,FGF-2)是一种神经营养因子,是成纤維生长因子的一种,它在細胞的复制、分化等起到调节作用[8,9],在神经系统中具有广泛的作用,表达于多种细胞类型,包括神经元细胞和神经胶质细胞等[8,10]。FGF-2在大脑损伤后和多种神经細胞中受调控的神经保护作用中出现上调[9]。已经有实验证实敲除FGF-2的SOD1G93A小鼠的可观察到发病推迟、生存期延长、症状相对较轻等[11]。本研究在此基础上利用ALS转基因模型,即SODlG93A小鼠,来研究SOD1G93A小鼠症状早起及症状终末期大脑皮层、小脑、腰段脊髓以及肌肉组织中FGF-2的表达差异,进行western bloting和荧光定量PCR实验验证表达谱结果,探索ALS疾病中各个组织中FGF-2的表达变化,探讨其在该病的发生发展中起到的作用及意义。方法:1转基因鼠的繁殖所有本实验中使用到的小鼠全都在恆温、恆湿、无特定病原菌(specific pathogen free,SPF)的环境中饲养,使用SPF级颗粒型鼠类饲料和无菌水喂养。为了B6SJL.Tg N(SODlG93A)1Gur转基因小鼠突变基因稳定下传的維持,使用B6SJLSODl G93A/+杂合子雄鼠与B6SJLFl/J杂合子雌鼠进行交配繁殖,这两种小鼠均购買于美国Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)。密切观察小鼠,并于小鼠3-4周时剪取子代鼠尾尖部组织进行基因鉴定,以明确其是否携带有人突变SODl(h SOD1)基因。2实验分组实验分为实验组和同窝对照组。实验组为随机选取不同时期的SOD1G93A雌性转基因小鼠,同窝对照组分别为雌性非转基因同窝小鼠。取症状终末期各组小鼠各3只用于进行免疫印迹实验,取30天、60天、90天及症状终末期各组小鼠各3只用于进行荧光定量PCR实验。3试验方法3.1取材各个时期的各组小鼠用百分之十的水合氯醛进行腹腔内注射麻醉后,分别以4%多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取大脑皮层、小脑、脑髓和肌肉组织并迅速投入液氮速冻后于.80℃冰箱保存。其中用于western blot实验的小鼠进行新鲜取材。用于RT-PCR的小鼠进行固定保存。3.2免疫印迹(Western blotting)分别提取大脑皮层、小脑、腰髓以及后腿肌肉总蛋白,用BCA法测蛋白浓度。使用10%或12%SDS,进行PAGE电泳后,使用PVDF膜進行转膜,使用PBS稀释过的5%的脱脂奶粉室溫封闭l小时,再分别加入鼠抗GAPDH抗体(1:500)和兔抗FGF2抗体(1:500)。4℃环境摇床中过夜。第二天,先使用TPBS洗3次,每次持续5分钟左右。再分别加入抗鼠和抗兔荧光二抗(1:10000)室温孵育l小时,然后用TPBS洗3次,PBS洗1次,每次5分钟。再用Odyssey红外扫描仪(美国LI.COR公司)扫膜并且分析其结果。最后,计算需要的目的条带和GAPDH灰度的比值并且再进行相关的统计学处理。3.3荧光定量PCR进行小鼠脊髓腰段的新鲜取材,迅速置于液氮中,于-80℃冰箱中保存。提取样本的RNA并且进行反转录后,再使用Stratagene Mx3005P荧光定量PCR仪扩增实验所需的目的基因。计量资料用x±s表示,采用SPSS 13.O软件进行统计学处理,统计方法为成组数据的t检验,各时期间比较采用Student-Newman-Keuls检测。采用检验水准a=0.05,P<0.05为有差异,有统计学意义。结果:1转基因鼠的鉴定子代小鼠基因鉴定结果:对待检小鼠基因组PCR产物进行电泳,内参照IL.2的条带(324 bp)位于300.400bp之间;突变SODl基因的条带(236bp)位于200.300bp之间。对PCR产物进行纯化测序,以确定其片段大小为236bp,证实其为h SODl基因目的条带,存在G93A位点(GCT替代GGT)突变。2目的蛋白的表达转基因小鼠中阳性小鼠较对照组阴性小鼠肌肉组织中FGF-2的含量增加(P<0.05),其他部位含量没有显著变化。3 RT-PCR结果我们检测了不同时期转基因小鼠大脑皮层、小脑、腰段脊髓及肌肉中FGF2 m RNA的表达。与同窝对照相比,SODl G93A转基因小鼠在30天,60天,120天以及症状终末期脊髓中FGF-2基因表达均无明显变化。结论:本实验在SODlG93A转基因小鼠模型中,发现疾病症状终末期肌肉中FGF-2水平有所增高(P<0.05),其他部位其含量没有明显变化;各时期FGF-2 m RNA水平没有发现明显变化。提示FGF-2的表达及其在各组织中水平的变化与ALS有关,其具体作用有待进一步研究。