研究背景和目的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)感染呈世界性分布,大量临床及流行病学资料表明,H. pylori感染导致的黏膜炎症反应是引起诸多胃黏膜相关疾病的基础,与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴瘤和胃癌等疾病密切相关,己被世界卫生组织下属的国际癌症研究机构(IARC)列为Ⅰ类致癌因子。目前临床常用的H. pylori诊断方法包括侵入性和非侵入性两大类,各有其优缺点和适用范围。其中组织切片染色的敏感性和特异性均较高,可同时观察黏膜病理学变化,但传统组织学属于有创检查且需时较长,无法实现即时诊断。共聚焦激光显微内镜(CLE)是一种新型的内镜技术,在进行常规电子内镜检查的同时,可通过小型化的共聚焦显微镜提供近1000倍放大的消化道黏膜图像,达到与横切病理切片相似的成像效果,有助于内镜医师在操作过程中作出即时的组织学诊断并指导靶向活检。目前已有应用CLE实时诊断H. pylori感染的个案报道,但该技术在临床应用中的诊断敏感性、特异性等指标尚未明确。在胃黏膜疾病的演进过程中,Correa所提出的慢性浅表性胃炎-萎缩性胃炎-胃黏膜肠上皮化生-上皮内瘤变-肠型胃癌的多阶段模型已被广泛认可。鉴于H. pylori为重要的致癌因素,长期以来H. pylori根除治疗对胃癌发生的预防作用也得到了广泛的关注。目前已证实根除H. pylori可缓解胃黏膜炎症,但对萎缩和肠上皮化生的影响仍存在很大争议,在萎缩肠化发展过程中可能存在“不可逆转点”,若超过该点则难以逆转,由于肠上皮化生在胃内常呈灶状分布,普通内镜下随机活检的取样误差是影响结果的重要因素。除H. pylori感染外,黏膜致癌过程还包括宿主和外界环境因素的参与。正常的胃黏膜上皮屏障可有效防御和抵抗各种有害理化因素的损伤,黏膜屏障的损伤己被发现与食管反流病、肠易激综合征、炎症性肠病、结肠瘤变、胃癌等多种疾病相关。作为常见的癌前状态,由于局灶分布取材困难,肠化生黏膜中的上皮屏障功能尚未见研究。借助于CLE可在镜下准确区分正常胃黏膜和肠化黏膜,同时CLE对比剂荧光素钠也是广泛应于上皮细胞通透性研究的小分子标记物,可反映胃上皮屏障的完整性,从而使CLE可全面观察不同黏膜状态在H. pylori根除前后的形态和功能学改变。伴肠上皮化生的胃黏膜经长期演变,部分可发展为高级别上皮内瘤变及早期胃癌。对于此类病变,早期发现和及时治疗是改善患者预后的关键,内镜下黏膜切除术(EMR)是目前对早期胃黏膜瘤变内镜治疗的主要方法,己在临床广泛应用并积累了丰富经验。残余病灶的复发是EMR治疗后的主要间题,病灶的水平和垂直安全边界均必须充分考虑,但在分块切除或病灶边缘烧灼严重的情况下,对EMR标本的水平安全边界常难以判断,只能依靠术后内镜随访对切除边缘的多次活检。若可将CLE的实时病理优势发挥在对EMR病灶切缘的在体判断中,则可望提高内镜完全切除的成功率,改善患者预后。本课题拟围绕CLE在H. pylori相关胃黏膜疾病中的应用开展研究,研究目的包括：1.总结吖啶黄染色下胃黏膜H. pylori感染的直接和间接征象,前瞻性研究共聚焦显微内镜对H. pylori感染的实时诊断效率。2.胃黏膜在H. pylori感染及肠上皮化生等情况下,是否存在胃上皮屏障功能的损伤；应用H. pylori根除治疗对胃内肠化黏膜和非肠化黏膜的影响差别。3.前瞻性评估共聚焦显微内镜在辅助判断EMR切除完全性中的价值。研究方法第一部分：共聚焦显微内镜对H. pylori感染的实时诊断应用整合式共聚焦显微内镜(Pentax EC3870K),以黏膜表面喷洒吖啶黄作为对比剂,对2008年8月至2009年3月间计划行胃镜检查且符合纳入标准的连续患者进行CLE检查。研究过程分为两个阶段,第一阶段选取前20位患者的共聚焦图像及相应横切病理图像,由3位内镜专家和1位资深病理专家进行开放式评估,总结CLE下H.pylori感染的特征,建立H.pylori感染的诊断标准。第二阶段对83位连续患者进行前瞻性CLE检查,分别观察其胃窦、胃体的大弯及小弯侧黏膜,根据制定的CLE诊断标准实时判断是否存在H.pylori感染征象。将活检组织改良Giemsa染色和快速尿素酶试验结果作为金标准与CLE结果进行对照,评估其诊断效率。同时随机选取50位患者图片,由3名未参加实时判断的CLE内镜医师进行观察者间一致性检验。第二部分：共聚焦显微内镜下H.pylori与胃肠上皮化生对黏膜屏障功能的影响选择2009年1月至2009年11月间来院就诊的己知胃黏膜肠上皮化生患者,同意行CLE检查代替普通内镜者纳入研究。先行普通白光模式观察,之后静脉给予5m1 10%荧光素钠作为对比剂,开启共聚焦显微模式进一步观察。操作者在CLE引导下选择性区分患者胃内的肠化及非肠化黏膜,各取靶向活检2块,1块用于观察黏膜的病理组织学改变,另1块用于硝酸镧示踪电镜观察上皮屏障紧密连接改变,记录电镜下每50个紧密连接中出现硝酸镧阳性标记的比例。同时利用荧光素钠作为上皮细胞间通透性标记物的特点,在CLE下分别对肠化及非肠化黏膜的上皮细胞间隙进行观察,以细胞间隙出现白亮的荧光素渗出为紧密连接受损,根据视野内荧光素渗出范围评为0-4分,将CLE镜下对紧密连接的评分与硝酸镧示踪电镜评分进行对照。初次CLE观察结束后,肠化患者中H.pylori阳性者接受2周的三联根除治疗,6个月后对患者进行随访,同前步骤进行CLE和示踪电镜观察,对比不同黏膜状态对H.pylori根除治疗的反应效果。第三部分：共聚焦显微内镜对EMR切除完全性的辅助判断纳入2009年1月至2010年3月在我院因胃上皮内瘤变和早期胃癌拟行EMR治疗的患者,患者术前均经超声内镜检查评估病灶的垂直深浸润度,确认病灶位于黏膜层。EMR操作经普通内镜应用透明帽辅助法或注射-圈套器切除法进行。以EMR标木边界无残余瘤变且术后内镜随访阴性认为完全切除,若边界存在瘤变定为切除失败,垂直边界残余者转外科手术治疗。EMR术后2周通过共聚焦显微内镜观察切缘,操作者根据CLE下瘤变标准对切缘是否存在残余病灶行进实时判断,若无阳性发现则对切缘行常规随机活检,若怀疑残留病灶存在,则在揭盲后进行追加EMR治疗。将首次切除、追加切除和随访活检的结果作为最终诊断与CLE诊断进行对照。研究结果第一部分：第一阶段结果显示H. pylori感染患者的胃上皮共聚焦图像与横切病理具有良好的一致性,以共聚焦图像中出现以下三个特征之一诊断为H.pylori感染：1.直接征象：胃小凹及表面上皮查见白色点状菌体；2.间接征象：胃黏膜表面见较多中性粒细胞浸润,中性粒细胞在吖啶黄染色后可出现特异性细胞核结构；3.间接征象：胃小凹和上皮内的微小脓肿形成。在第二阶段的前瞻性研究中,共获得6823幅CLE图像,平均82幅/每人,共37名(44.6%)患者被最终诊断为H. pylori感染。CLE在体诊断H. pylori感染的准确性、敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为92.8%,89.2%,95.7%,94.3%,和91.7%。CLE图像的观察者间差异kappa值为0.78,在各诊断征象中,中性粒细胞浸润兼有良好的敏感性和特异性(83.8%和97.8%)。CLE下的H. pylori感染改变在胃窦部较胃体部更为明显(94.3%vs 45.7%,P<0.001)。第二部分：共计42名胃肠上皮化生患者纳入研究,其中H. pylori阳性患者20例。在透射电镜示踪下,胃黏膜上皮紧密连接破坏时在上皮间隙可见硝酸镧标记,H. pylori阳性患者中肠化和非肠化标本的电镜通透性评分值分别为54±31%和72±28%, H. pylori阴性患者肠化标本的通透性评分值为67±34%,三者均显著大于H. pylori阴性非肠化标本(3±6%,均p<0.05)。CLE下上皮细胞间荧光素渗出评分与电镜示踪结果一致,H. pylori日性患者中肠化和非肠化上皮CLE通透性评分值分别为2.60±1.03和2.83±0.81, H. pylori阴性患者肠化上皮通透性评分值为2.82±1.00,三者同样均高于H. pylori阴性非肠化上皮(0.21±0.24,均p<0.05)。CLE下出现上皮细胞间荧光素渗出的黏膜分布与示踪电镜具有高度一致性(R值=0.834,p<0.0001)。6个月后20名接受根除治疗的患者中18名返回随访,其中14例H. pylori根除成功。经CLE与示踪电镜结果显示,根除后非肠化黏膜的通透性评分较根除前得到显著改善(均p<0.001),但肠化区黏膜通透性评分未见明显改善(p>0.05)。第三部分：经超声内镜检查后,共对27名患者的27处早期胃瘤变病灶进行了EMR治疗,其中19例为整体切除,8例为分块切除。对切除标本行病理检查后,3例因垂直边缘检出瘤变定为切除失败行手术治疗。剩余的24名患者两周后接受CLE检查,其中有9名患者因分块切除和边界判断困难进行了至少2次CLE随访。随访过程中7名患者在CLE下被怀疑存在腺体结构异常。最终病理结果证实其中的5名患者切缘存在上皮内瘤变(2例高级别瘤变和3例低级别瘤变)。CLE对EMR切除完全性预测的准确性、敏感性和特异性分别为91.7%,100.0%和89.5%。经CLE观察后6名患者接受了CLE引导下的追加EMR治疗,经平均8.3个月的随访后未再发现残余灶和复发。研究结论：1.共聚焦显微内镜可对H. pylori感染胃黏膜表面的细微结构清晰成像,CLE对H. pylori感染的实时诊断快速简便,具有较高的准确性。2. H. pylori感染及肠上皮化生均可导致胃上皮屏障中紧密连接破坏增加,通透性升高。H. pylori根除治疗可显著改善非化生黏膜的上皮屏障损伤,但肠化上皮屏障的损伤难以被根除治疗逆转。共聚焦显微内镜下可利用荧光素钠作为标记物反映上皮细胞间连接的通透性,其结果与示踪电镜具有良好的一致性。3.共聚焦显微内镜对EMR术后残余瘤变具有良好的诊断效率,结合CLE引导下的追加治疗有助于提高内镜治疗的成功率研究意义：本研究证实CLE可在内镜检查过程中提供即时可靠的黏膜组织学诊断,建立的CLE下H. pylori感染诊断标准经前瞻性检验具有良好的诊断效率,同时进行的靶向活检可避免随机活检误差的发生。首次在体验证了H. pylori和肠化生改变对胃上皮屏障的损伤作用,并通过靶向取材发现胃肠化黏膜和非肠化黏膜对H. pylori根除的改善效果不同,有助于临床中H. pylori根除更有针对性的应用,也提示上皮屏障损伤机制可能参与了胃黏膜的瘤变过程。我们发现荧光素钠渗出与上皮细胞间通透性增加存在相关性,有望成为一种在体检测上皮细胞间通透性的新方法。同时,本研究首次将CLE的应用拓展至内镜治疗中,对改善EMR等内镜治疗的完全切除率和优化内镜随访方案具有较强临床意义。