几丁质是自然界含量最丰富的的生物质资源之一。它是昆虫表皮中一种重要的结构组分,具有保护昆虫免受外界侵害等作用,但其紧致刚性的特点也会限制昆虫的生长发育。因此,昆虫的生长发育往往伴随着周期性的几丁质合成及降解。昆虫体内存在一个高效、复杂的几丁质降解系统,能够在蜕皮过程中快速降解几丁质以满足自身生长发育的需要。参与昆虫表皮水解的主要有三种几丁质酶(ChtⅠ,ChtⅡ和Chi-h)。其中,ChtⅡ是一个超大的含有多个结构域的复杂的几丁质酶,其在昆虫蜕皮过程中具有重要作用。但对于含有多个结构域的ChtⅡ,其酶学活性及其在昆虫蜕皮过程中的作用并不清楚。本论文以亚洲玉米螟几丁质酶OfChtⅡ为主要研究对象,开展了如下研究工作:(1)在毕赤酵母表达系统中重组表达OfChtⅡ截短体OfChtⅡ-B4C1,经金属螯合层析分离纯化,通过SDS-PAGE电泳和Western Blot分析后获得纯的目的蛋白,其实际分子量为120 kDa,产量约为5 mg/L。(2)以α-几丁质为底物测定OfChtⅡ-B4C1酶学活性。结果表明,OfChtⅡ-B4C1对α-几丁质具有很好的水解活性。通过电镜观察,OfChtⅡ-B4C1可以明显破坏几丁质致密结构,使其坍塌,表面变蓬松。通过观察其水解后的昆虫表皮发现,OfChtⅡ-B4C1可以使昆虫表皮出现更大的孔状结构,形成断裂的几丁质纤维。(3)通过Real-Time PCR以及Western Blot的方法,分别从基因和蛋白质两个水平检测分析了 OfCht、OfChtⅡ、OfChi-h三种几丁质酶的表达时期差异。结果表明,OfChtⅡ在昆虫中的表达时期早于OfCht和OfChi-h。通过向亚洲玉米螟体内注射20E,同样发现OfChtⅡ在昆虫体内对20E的应答早于OfChtⅠ和OfChi-h。(4)制备了 OfChtⅠ和OfChi-h。以α-几丁质为底物,检测三种几丁质酶降解几丁质的活性差异。电镜结果表明,OfChtⅡ可以明显的破坏几丁质致密的结构,OfChtⅠ和对几丁质的水解活性较弱,OfChi-h的作用效果介于二者之间。三种几丁质酶在水解α-几丁质过程中彼此间均存在协同作用。进一步比较了亚洲玉米螟和粘质沙雷氏菌两个几丁质降解系统对不同几丁质底物的水解活性发现,昆虫几丁质降解系统能够有效的降解α-几丁质,而对β-几丁质的水解活性弱于细菌降解系统。本论文预期结果将有助于揭示昆虫几丁质酶降解几丁质的机制。研究昆虫几丁质酶降解几丁质的机制有助于实现以几丁质作为生物质资源的高效利用以及以昆虫几丁质降解过程为靶标设计特异性生物农药。