研究目的:虽然胰腺创伤比较罕见,其发生只占创伤患者的2%~5%,占闭合性腹部创伤的5%和腹部穿通伤的2%~6%。但是由于其常常难以察觉和治疗棘手,因而有较高的并发症发生率和死亡率。由于胰腺创伤的早期症状及体征不明显,经常直到创伤所致的急性胰腺炎出现才引起注意。创伤导致的急性胰腺炎也被称之为创伤性胰腺炎(TP),其经常伴随一些严重的并发症,如全身炎症反应综合征(SIRS)、休克、多器官功能衰竭(MOF)等等。尽管其它原因所致的急性胰腺炎的发病机制和治疗效果已经有了广泛的研究,但是很少有学者关注创伤所致的急性胰腺炎的发病机制及治疗。高迁移率族蛋白1(HMGB1)是核内高度保守的非组蛋白染色体蛋白,其主要稳定核小体的结构并调节基因转录。HMGB1可以主动或被动从细胞中释放并在各种疾病中起重要作用,且与疾病的严重程度密切相关。因此,HMGB1被认为可能是抗炎治疗的一个靶点,HMGB1的抑制剂也成为治疗这些疾病的潜在的新的治疗策略。然而,HMGB1与TP之间的关系还没有相关的研究,HMGB1的抑制剂在TP的治疗上也未见报道。最近,甘草酸苷(GL)被确认为是HMGB1的抑制剂,其直接结合HMGB1并抑制其细胞因子活性。GL是甘草的主要活性成分,通常用于治疗慢性肝炎患者。该化合物与许多药理作用相关,包括抗炎,抗病毒,抗肿瘤和保肝。然而,GL在治疗TP中的作用及机制还未曾有过研究。我们已经研发了一个单纯的创伤性胰腺炎大鼠的实验模型,并已在创伤性胰腺炎的机制和治疗方法上做了一些研究。因此,我们将研究HMGB1在TP中的作用以及其抑制剂GL治疗TP的效果及机制。方法:第一部分:HMGB1在大鼠创伤性胰腺炎中的作用将48只Wistar大鼠随机分为6组(每组8只),分别是①假手术对照组(control组),②创伤性胰腺炎6h组(TP 6h组),③TP 12h组,④TP 24h组,⑤TP 48h组,⑥tp72h组。tp大鼠模型的制备采用bim-Ⅲ型生物撞击机产生的一个恒定的400kpa压力的压缩空气来冲击大鼠胰腺体部固定区域。在相应的时相点,人性化处死大鼠后,再取血及胰腺标本用于检测以下指标:血清淀粉酶,血清hmgb1及tnf-α,胰腺组织大体病理变化、组织光镜下病理变化及病理评分,胰腺组织hmgb1免疫组化分析,westernblot检测胰腺组织hmgb1蛋白的表达,胰腺病理评分与hmgb1表达的相关性。第二部分:hmgb1抑制剂甘草酸苷在大鼠创伤性胰腺炎中的保护作用将60只wistar大鼠随机分为3组(每组20只),分别是①假手术对照组(control组),②创伤性胰腺炎24h组(tp组),③创伤性胰腺炎甘草酸苷治疗组(tp-gl组)。另外,再增加60只大鼠按照上述分组和处理办法,用于检测各组大鼠的7d的生存率。tp大鼠模型的制备采用第一部分的方法。在相应处理后24h人性化处死大鼠,再取血及胰腺标本用于检测以下指标:血清淀粉酶,血清hmgb1、tnf-α和il-6,胰腺组织大体病理变化、光镜下组织病理变化及病理评分,tunel法检测胰腺细胞凋亡及计算凋亡指数,westernblot检测胰腺组织caspase3蛋白的表达,胰腺组织超氧化物歧化酶(sod)及丙二醛(mda)活性检测。第三部分:hmgb1抑制剂甘草酸苷在大鼠创伤性胰腺炎中的作用途径及分子机制将60只wistar大鼠随机分为3组(每组20只),分别是①假手术对照组(control组),②创伤性胰腺炎24h组(tp组),③创伤性胰腺炎甘草酸苷治疗组(tp-gl组)。tp大鼠模型的制备采用第一部分的方法。在相应处理后24h人性化处死大鼠,再取血及胰腺标本用于检测以下指标:胰腺组织hmgb1、tlr4、nf-κb免疫组化分析,westernblot检测胰腺组织hmgb1、tlr4蛋白的表达,real–timepcr检测胰腺组织hmgb1、tlr4mrna,emsa法检测胰腺组织nf-κb,elisa法检测胰腺组织tnf-α及il-6,胰腺组织中hmgb1与tlr4、nf-κb之间的相关关系。结果:第一部分:hmgb1在大鼠创伤性胰腺炎中的作用1.tp大鼠血清淀粉酶从制模后6h开始明显增加,到12h时进一步上升,直到24h达到高峰值,随后于48h开始下降,到72h时降至control组基线水平。2.tp大鼠血清tnf-α从制模后6h开始明显增加,12h达到峰值,24h开始下降,48h、72h均降至基线水平。而tp大鼠血清hmgb1从制模后6h开始上升,12h明显升高,随后于24h达到顶峰,48h、72h均下降。3.tp大鼠各时相点胰腺大体病理、胰腺组织学观察及病理评分情况表明:胰腺组织损伤在制模后6h开始明显升高,12h继续升高,24h达到峰值,随后在48h开始下降,72h继续下降。4.tp大鼠各时相点胰腺组织hmgb1免疫组化及westernblot检测情况表明:hmgb1在制模后6h开始上升,12h明显增高,24h达到峰值,48h、72h出现下降。5.tp大鼠血及胰腺组织中hmgb1与胰腺组织病理评分具有正相关性,相关系数分别为r=0.841及r=0.83。第二部分:hmgb1抑制剂甘草酸苷在大鼠创伤性胰腺炎中的保护作用1.kaplan-meier生存曲线显示tp-gl组7天生存率明显高于tp组(65%versus45%),表明gl可能改善了tp大鼠的生存率。2.tp组和tp-gl组血清淀粉酶水平均高于control组,tp-gl组血清淀粉酶水平轻度低于tp组,但是没有统计学意义,表明gl不具有胰酶抑制作用。3.tp组和tp-gl组血清tnf-α、il-6和hmgb1水平均显著高于control组。然而,与tp组相比,三种促炎细胞因子在tp-gl组都显示出了明显的降低,表明gl能抑制早期及晚期炎症介质。4.tp组和tp-gl组的胰腺组织病理损伤显著高于control组,但是tp-gl组的情况好于tp组,表明gl能改善tp大鼠的胰腺病理损害。5.tp组和tp-gl组凋亡水平显著高于control组,但tp-gl组凋亡水平显著低于tp组,表明gl能抑制tp大鼠胰腺腺泡细胞凋亡。6.tp组及tp-gl组sod水平比control组明显降低,但tp-gl组的sod水平较tp组显著升高;而tp组胰腺组织mda水平组显著升高,tp-gl组的mda水平较tp组有明显的降低,表明gl能改善tp大鼠胰腺的氧化应激状况。第三部分:hmgb1抑制剂甘草酸苷在大鼠创伤性胰腺炎中的作用途径及分子机制1.tp组大鼠胰腺组织中hmgb1的表达明显增加,而tp-gl组明显减少。表明gl能抑制tp大鼠胰腺组织中hmgb1的表达。2.tp组大鼠胰腺组织中tlr4的表达明显增加,而tp-gl组明显减少。表明gl能抑制tp大鼠胰腺组织中tlr4的表达。3.tp组大鼠胰腺组织中nf-κb的水平明显增加,而tp-gl组明显减少。表明gl能抑制tp大鼠胰腺组织中的nf-κb。4.tp组大鼠胰腺组织中tnf-α及il-6水平显著增加,而tp-gl组显著降低,表明表明GL能抑制TP大鼠胰腺组织中的TNF-α及IL-6。5.TP大鼠胰腺组织HMGB1的表达与TLR4、NF-κB的表达均具有正相关关系,提示GL对TP大鼠的保护作用可能是通过抑制HMGB1-TLR4-NF-κB通路起作用。结论:TP大鼠血清及胰腺组织中HMGB1明显增加,并且与TP大鼠胰腺病理评分呈正相关性,HMGB1的水平可以作为评估TP严重性的一项重要观察指标。而GL治疗TP大鼠后,提高了7天生存率,降低了血清早期及晚期炎症介质,改善了胰腺组织病理损伤,降低了胰腺组织的凋亡水平,改善了胰腺组织的氧化应激状况。TP导致了大鼠胰腺组织中HMGB1-TLR4-NF-κB通路激活及炎症因子水平升高,而GL能抑制该通路激活并降低炎症因子水平。因此,我们的研究表明GL对TP大鼠胰腺组织具有保护作用。