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前言重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)死亡率高,预后差。SAP的发病机制十分复杂,目前认为是一种由多种炎症介质参与,以中性粒细胞、单核巨噬细胞和内皮细胞为效应细胞的全身性炎症反应。SAP来势凶猛,病程进展快,死亡率高达20%-30%。肠道是应激反应的中心器官之一,大量研究显示SAP容易发生肠屏障功能障碍(intestine barrier functional disturbance,IBFD),IBFD是SAP并发感染、甚至形成腹腔脓肿,诱发和加重全身炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能障碍综合征(MODS),且死亡率居高不下的症结所在。随着对SAP发病机理研究的深入,人们逐渐认识到SAP时出现的全身炎症反应综合征(systemic inflammation response syndrome,SIRS)及由此引起的多脏器功能衰竭(multiple organ failure,MOF)是SAP高死亡率的主要原因,阻断SIRS发生的某一环节将有助于减少MOF的发生,降低死亡率。SAP的发生与大量细胞因子级联反应引起的全身炎症反应综合征(SIRS)密切相关。SIRS是造成多器官功能不全综合征(MODS)的重要原因。越来越多的证据表明:SAP时各种炎性细胞产生的促炎性细胞因子是导致SIRS发生的关键因素,因此学者们推测采用细胞因子抗体或其它拮抗细胞因子的方法可能会减轻SAP的炎症反应,后来的实验虽然证实了这一结论,但是治疗结果并不理想。究其原因在于SAP时SIRS的发生是通过许多细胞因子构成的一个复杂的细胞因子网络介导的,细胞因子的数量众多且存在互相协同、互相诱生等多种复杂的相互作用,因此,单独阻断某一个或少数细胞因子的作用很有限,往往达不到治疗目的如何才能有效调控细胞因子的产生,阻断SIRS和MOF的发生,对于SAP的防治研究具有重要意义。尽管现在发现参与炎症反应的细胞因子数量众多,但细胞内参与调控细胞因子产生的信号转导通路却并不多。如能对关键的信号转导通路进行有效的阻断和调节,则可以十分有效地调控促炎细胞因子的产生,从而阻断SIRS和MOF的发生或减轻其严重程度,进而提高治疗效果。因此研究信号转导通路在SAP发病机制中的作用具有重要意义。近10余年临床研究显示,早期释放的炎症因子如TNF-a、IL-1等均在模型建立后迅速升高至峰值,并迅速下降,而此时炎症反应仍在继续,并且临床应用TNF-a、IL-1受体拮抗剂并未取得显著效果,提示可能存在晚期炎症介质参与病理反应。最近研究表明,高迁移率族蛋白-1(high mobility group box1,HMGB1)是相对于肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1b(IL-1b)新的“晚期”炎症因子。高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HM GB1)是一类广泛存在于真核细胞内的非组核蛋白,是一大类高度保守的蛋白质,分子量较低(30 kDa),带电荷氨基酸含量丰富,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移迅速而得名。HMGB1是HMG家族成员之一,既往的研究表明,HMGB1可参与DNA复制、细胞分化及基因表达等多种细胞生命活动。最近有研究发现,细胞经内毒素刺激后,可将HMGB1分泌到细胞外,介导了内毒素的致死效应。由于内毒素攻击后HMGB1的产生明显晚于其他介质并持续时间较长,故被称为脓毒症的“晚期”介质。HMGB1通过两种不同的途径释放至细胞外:活化的单核/巨噬细胞的主动分泌和坏死细胞的被动释放,同时存在内源危险信号的两种不同释放机制说明了HMGB1作为内源性炎症介质的重要性。与TNF-α和IL-1b等早期细胞因子相比,HMGB1出现较晚且持续时间更长,因而可能成为脓毒症防治切实可行的潜在干预目标,能给脓毒症和其他SIRS提供更广的治疗窗。丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate,EP)是一种稳定的亲脂性丙酮酸衍生物,许多研究表明他具有抗炎和免疫调节作用。我们通过牛磺胆酸钠逆行胰胆管内注射诱发大鼠重症急性胰腺炎模型,观察丙酮酸乙酯对相关炎症因子的调节,探讨丙酮酸乙酯对重症急性胰腺炎的保护作用及其机制,乃临床治疗提供理论依据。·论文一·重症急性胰腺炎大鼠高迁移率族蛋白B1表达与肠粘膜屏障损害的关系方法48只Wistar大鼠随机分为正常对照组(n=8)和SAP组(n=40)。SAP组分别于建模后3、6、12、24、48h取材。测定血浆内毒素(LPS)、二胺氧化酶(DAO)水平,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肠组织高迁移率族蛋白B1(HMGB1)mRNA表达,western blot法检测肠组织HMGB1水平。结果与正常对照组相比,SAP发病后6h,大鼠血浆中LPS含量与DAO水平即上升,24h达峰值,48h仍显著高于正常对照组(P＜0.01)。正常情况下大鼠肠组织中有少量的HMGB1表达,SAP模型制成6h后,大鼠肠组织中HMGB1表达开始增高,较对照组差异显著(P＜0.01);12h呈现进一步升高趋势,24h达峰值,至48h仍维持在较高水平。结论1、SAP大鼠肠组织中HMGB1表达延迟且持续增高。HMGB1作为晚期炎症介质参与了SAP大鼠肠粘膜屏障损伤的病理生理过程。2、SAP时,肠组织内HMGB1表达上调,肠屏障损伤加重;可通过抑制SAP时肠组织内HMGB1表达,改善肠屏障功能3、逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠可成功复制大鼠SAP动物模型。·论文二·丙酮酸乙酯对重症急性胰腺炎大鼠肠粘膜的保护作用方法逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠制作SAP模型。雄性Wistar大鼠随机分成3组:假手术组、SAP组和EP治疗组。测定血浆LPS、D-乳酸含量,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肠组织HMGB1 mRNA表达,Western-blot法进行HMGB1检测。通过光学显微镜观察肠组织病理变化及免疫组织化学法观察HMGB1在肠组织中的表达。结果SAP建模后6h,大鼠血浆中LPS含量和D-乳酸含量上升,24h达峰值,48h仍显著高于正常对照组(P＜0.05);EP治疗后,大鼠血浆LPS含量和D-乳酸含量显著降低。(P＜0.05)。SAP组大鼠肠组织HMGB1mRNA表达水平在SAP后12 h明显升高,至24h达峰,48h仍维持在高水平。EP治疗组肠组织HMGB1mRNA表达水平均明显低于SAP组(P＜0.05)。结论1、SAP时,HMGB1可介导肠粘膜通透性增加。2、丙酮酸乙酯能显著下调血浆LPS含量和D-乳酸水平并明显抑制HMGB1基因表达,改善肠粘膜屏障功能,对SAP肠粘膜损伤有明显保护作用·论文三·HMGB1对血管内皮细胞ECV-304活化作用的研究方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)株ECV-304分为对照组、HMGB1刺激组、丙酮酸乙酯(EP)处理组,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清TNF-a水平变化,免疫荧光显微镜观察血管内皮细胞NF-κB活性的变化,免疫细胞化学染色法检测RAGE表达,凝胶迁移率实验(EMSA)检测细胞内NF-κBDNA结合活性的变化。结果HMGB1可诱导人脐静脉内皮细胞NF-κB在短时间内活化,促进TNF-a表达和RAGE表达上调;EP处理后可显著降低NF-κB活性,抑制TNF-a和RAGE表达。结论1、HMGB1可能通过活化血管内皮细胞NF-κB进而诱导TNF-a分泌,参与脓毒症的病理生理过程。2、EP可通过拮抗HMGB1刺激血管内皮细胞NF-κB活化从而发挥保护作用。3、HMGB1可能部分通过RAGE介导了细胞内信号转导过程;HMGB1刺激血管内皮细胞后RAGE表达上调。4、阻断或封闭RAGE后可减轻炎症反应和细胞损伤。