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糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)的外用制剂是皮肤科常用药物,其疗效确切。但在临床工作中我们发现,许多患者外用GC一段时间后,其疗效会迅速降低,这种现象被称为“快速减敏(tachyphylactic)”。系统使用GC时也会发生类似的药物效能降低的现象,被称为“激素抵抗”。GC进入细胞后,与胞浆中糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)结合,然后被转运至核内,活化GC靶基因,发挥抗炎作用。已有研究证实核转运障碍是快速减敏或激素抵抗的关键机制。GR有GRα、GRβ、GRρ、GRγ,GRα、和GRβ是主要的两种受体。α亚型属于功能型,β亚型属于拮抗型。GRα可与GC结合,正常转运GC,激活靶基因;然而GRβ则既不能与GC结合,也不能活化GC靶基因,只能与GRα相结合并抑制其活性。近年来,钙调神经磷酸酶抑制剂(Calcineurin inhibitors,CNI)类药物也被逐渐用于治疗炎症性皮肤病,包括用于激素依赖性皮炎的治疗,且临床治疗效果优于单纯使用激素类药物,尤其是对长期外用激素治疗已经出现激素抵抗的患者。基于既往的基础研究以及他克莫司(Tacrolimus,TAC)对激素依赖性皮炎的治疗作用,我们推测TAC不仅有控制炎症的作用,同时还可以延缓激素快速减敏的发生,其机制可能是通过调控皮炎局部的GRβ表达,拮抗了“糖皮质激素快速减敏”的过程。为了明确TAC是否能拮抗糖皮质激素的快速减敏,并阐明其分子机制,本实验在成功构建变应性接触性皮炎(Allergic contact dermatitis,ACD)小鼠模型的基础上,观察评价TAC拮抗糖皮质激素快速减敏的作用效果及检测皮炎局部GRβ表达的变化情况,并进一步在分子水平层面阐明TAC-NFAT轴是如何调控GRβ的转录表达。研究目的:旨在探究TAC-NFAT轴调控GRβ在拮抗糖皮质激素快速减敏中的作用机制,为临床工作中TAC与GC类药物的合理使用提供一定的实验基础和理论依据。研究方法:1.本实验用1%DNCB重复刺激Balb/c小鼠背部皮肤构建变应性接触性皮炎动物模型,以皮炎模型小鼠为对照组,并经随机分组后,分别用地塞米松(Dexamethasone,DEX)、TAC、DEX+TAC处理该动物模型。通过HE染色、炎症细胞计数和qRT-PCR检测TNF-α和IL-6的mRNA水平来反映不同处理组皮炎的变化情况,同时采用qRT-PCR、免疫印迹(Western blotting,WB)及免疫组化检测GRβ的mRNA和蛋白表达。2.TAC作用于角质形成细胞NCTC2544后,用qRT-PCR、WB检测GRβ、NFAT1和NFAT2的表达水平。构建含GRβ启动子序列的荧光素酶报告载体pGL3-basic-GRβ,双荧光素酶报告基因实验验证NFAT作用于GRβ启动子区域。NCTC2544细胞中干扰和过表达NFAT1和NFAT2后检测GRβ的变化。结果:1.HE染色分析与炎症细胞计数结果显示,与DNCB对照组相比,DEX处理组、TAC处理组、DEX+TAC处理组的表皮与真皮厚度均有明显降低,炎性病变对组织病理损伤减轻。与DEX处理组、TAC处理组相比,DEX+TAC处理组炎症细胞计数显著降低(P<0.05)。2.qRT-PCR结果发现:与DEX处理组、TAC处理组相比,DEX+TAC处理组TNF-α和IL-6的表达均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.与DEX处理组、TAC处理组相比,DEX+TAC处理组GRβ的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。4.免疫组化结果显示:与DNCB对照组相比,DEX处理组、TAC处理组、DEX+TAC处理组GRβ表达下降,相比较于DEX处理组、TAC处理组,DEX+TAC处理组GRβ表达水平降低更显著。5.与对照组(不加TAC作用)相比,TAC(1uM)组和TAC(10uM)组均能够抑制NCTC2544细胞中GRβ的mRNA和蛋白的表达水平,差异有统计学意义(p<0.05),并呈剂量依赖性。6.双荧光素酶报告基因检测结果显示,共转染NFAT1、NFAT2过表达载体和pGL3-basic-GRβ荧光素酶载体组的荧光素酶活性显著高于共转染对照载体NC和pGL3-basic-GRβ荧光素酶载体组(1.98±0.10vs1.03±0.17,2.80±0.42vs0.91±0.12),差异有统计学意义(**p<0.05)。该结果表明NFAT能作用于GRβ启动子区域。7.干扰降低NFAT1或NFAT2的表达后,与sicontrol组相比,siNFAT1组、siNFAT2组GRβ的mRNA和蛋白表达水平均显著下降,差异有统计学意义(p<0.05)。过表达NFAT1或NFAT2后,与NC组相比,NFAT1组、NFAT2组GRβ的mRNA表达水平显著上调,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1.钙调神经磷酸酶抑制剂TAC能够显著减轻DNCB诱导的变应性接触性皮炎的炎性损伤。DEX联合TAC处理后显著增强了DEX的抗炎作用。TAC在DNCB诱导的变应性接触性皮炎模型中能够显著抑制GRβ的表达,从而拮抗糖皮质激素的快速减敏,在变应性接触性皮炎模型中发挥重要的抗炎功能。2.该研究首次证实了NFAT1和NFAT2能够作用于GRβ的启动子序列区域调控GRβ的表达:TAC能够通过TAC-NFAT轴,调控GRβ的表达,从而拮抗糖皮质激素的快速减敏。阐明了TAC对炎症调控的作用机制,同时为临床工作中CNI与GC类药物的合理使用提供了理论指导和实验基础。