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红景天苷(化学名:对羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷,Salidroside),是酪醇(化学名:对羟基苯乙醇)的葡萄糖苷。红景天苷及其苷元酪醇首先发现于红景天中,是红景天属植物最重要的药效成分,随后也发现存在于女贞属、杜鹃属、越桔属等植物中。药理学研究显示,红景天苷具有良好的抗疲劳、抗缺氧、增强免疫力、保护心血管等多种功效。红景天及其主要成分红景天苷同样在许多特殊环境下使用,用来抵抗恶劣环境,提高机体免疫力,在军事、航天、运动及保健医学等方面具有重要的应用价值,同时也作为原料药和添加剂在化妆品、食品、保健品、药品等工业生产中广泛使用。论文以小叶女贞(Ligustrum quihoui Carr)叶片为实验材料,通过转录组测序,并与已报道的红景天植物中催化红景天苷合成的葡萄糖基转移酶基因进行比对,从中筛选出同源性高度相似的序列,利用cDNA末端快速克隆的技术(RACE)克隆得到小叶女贞中的糖基转移酶基因xynzUGT,将该基因与原核表达载体pET-28a进行连接,所得重组质粒再转入宿主细胞BL21(DE3),获得原核表达工程菌BL21-UGT-28a,工程菌经IPTG诱导表达,目的蛋白SDS-PAGE电泳检测,诱导条件优化,促溶性分析研究,从而为后续酶学性质研究奠定坚实的基础,本研究的主要内容如下:(1)采摘前体酪醇喷洒3天后的小叶女贞叶片为实验材料,提取得到小叶女贞叶片的总RNA,进行转录组测序,同时通过RT-PCR技术反转录出小叶女贞的cDNA,根据转录组测序结果设计RACE引物,得到小叶女贞3’RACE产物,将其与pMD19-T克隆载体连接,构建得到的克隆载体命名为pT-3’RACE,之后再转化到大肠杆菌DH5α中,经过菌液PCR鉴定,初步认定构建成功,进一步测序得到重组载体pT-3’RACE。(2)根据重组载体pT-3’RACE测序结果进行5’RACE引物设计,利用相同方法得到重组载体pT-5’RACE,将两次测序结果进行拼接获得xynzUGT全基因序列,引入酶切位点设计特异性引物在以cDNA为模板,最终得到xynzUGT的开放阅读框。(3)对xynzUGT进行生物信息学研究,酶蛋白分子量为54,826.67KD,等电点为5.82,根据同源建模、分子对接研究,结果表明酪醇自身苯环上的4号羟基和侧链羟基,能与酶蛋白中的Gly138和Ser285通过氢键实现相互作用。(4)将糖基转移酶基因xynzUGT与pMD19-T克隆载体相连接,得到重组载体pT-UGT,将其转化到大肠杆菌DH5α中,经过菌液PCR和双酶切鉴定,初步判断构建成功,进一步测序确定得到重组载体pT-UGT。用BamHI和xhol两个酶对克隆载体pT-UGT和原核表达载体pET-28a分别进行双酶切,使用T4 DNA连接酶将xynzUGT基因与原核表达载体pET-28a相连接,构建重组质粒pET-28a-UGT,将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,最终构建了原核表达工程菌BL21-UGT-28a。(5)对成功构建的工程菌进行培养,经IPTG诱导表达后,利用SDS-PAGE检测工程菌中目的蛋白的表达情况,结果表明目的蛋白在工程菌中有表达,在工程菌中表达的目的条带分子量约为54.8KDa。并从IPTG浓度、诱导时间、诱导温度这三个方面对工程菌BL21-UGT-28a的发酵条件进行优化,确定了最佳发酵条件为:IPTG浓度为0.25mM,诱导时间为5h,温度为37℃,转速为225rpm。(6)对工程菌进行可溶性鉴定发现,其以不可溶的包涵体形式表达,对工程菌表达的包涵体进行分子伴侣促溶表达,采用常用的三种包含分子伴侣的质粒pG-KJE7、pG-KJE8、PGro7,其中含有dnaK-dnaJ-grpE分子伴侣的pG-KJE7的促溶效果最佳,但表达量极低。