先天性肢端畸形是新生儿最常见的出生缺陷之一,发生率约为1‰到2‰。遗传物质变异和发育过程中的不良环境因素(如病毒感染、化学药物、电离辐射、异常的子宫内环境等)是肢端畸形发生的两大主要原因。多种基因突变和染色体畸变能直接导致肢端畸形发生,表现为指(趾)的数目、长度以及解剖形态的异常,如多指(趾)(polydactyly, PD)、缺指(趾)(ectrodactyly, ED)、短指(趾)(brachydactyly, BD)、并指(趾)(syndactyly, SD)等畸形。不同类型的肢端畸形可单独发生,也可交叉存在,如并多指(趾)(synpolydactyly, SPD)/短并指(趾)等。研究先天性肢端畸形致病基因突变及其发生机制,有助于明确肢端发育的调控机制,对指导遗传优生和提供产前咨询具有非常重要的意义和应用价值。本文以一个并多指(趾)畸形家系和一个手足裂畸形家系为研究对象,分别进行了致病基因筛查和突变检测,并对其中一个表型罕见的手足裂畸形家系的致病基因突变进行了初步功能研究。第一部分一并多指(趾)畸形家系HOXD13基因致病突变分析并多指(趾)畸形是一种罕见的常染色体显性遗传性肢端发育畸形,属于非综合征型Ⅱ型并指。典型临床特征是手3、4指和足4、5趾并指(趾),有蹼相连,不能分离；伴或不伴骨性融合的蹼间存在部分或完全复制的额外的指(趾)。并多指(趾)畸形是一种具有高度临床异质性和遗传异质性的手足畸形,不同家系间或同一家系不同患者间或同一患者的手足畸形表现度及外显率都存在显著差异。患者可单纯表现为单手(足)或双手(足)并指(趾)或并多指(趾),症状严重者可累及掌骨或跖骨,同时伴短指(趾)、屈指(趾)等指(趾)骨形态异常。据并多指(趾)畸形的遗传异质性,将其分为三个亚型：SPD1)(MIM186000)、SPD2(MIM608180)和SPD3(MIM610234),分别定位于染色体2q31、22q13.31和14q11.2-q12。HOX基因簇编码的高度保守的同源盒转录因子家族,在脊椎动物胚胎肢端发育和形态发生中,将不同的定位信息传送至肢体不同的部位,对机体的生长分化和其他生理过程具有重要的调控作用。HoXDl3基因位于染色体2q31,是第一个发现的与人类肢端发育相关的HOX基因。HOXDl3基因的四种突变类型可导致并多指(趾)畸形的发生：聚丙氨酸链延伸突变、缺失突变、无义突变和错义突变。其中,第一外显子聚丙氨酸链延伸突变是导致大多数典型SPD发生的主要原因。本研究旨在探讨山东一个典型并多指(趾)家系的表型及遗传特点并对该家系进行致病基因筛查和突变分析。首先,对该并多指(趾)家系中疑诊患者进行详细的临床和影像学检查明确诊断；然后据文献报道选择候选基因进行突变检测。通过聚合酶链式反应扩增HOXD13基因外显子及侧翼序列,对扩增产物进行直接测序和TA克隆测序检测致病突变。测序结果经Blast分析软件与GenBank提供的基因参考序列进行比对,明确突变类型。最后在家系内和群体中验证突变与该家系患者表型共分离,从而鉴定该家系的致病基因突变。该并多指(趾)家系5代均有成员患病,无隔代遗传现象,且男女均有发病,符合常染色体显性遗传特点。家系患者临床表型复杂多样,但都存在不同程度的并(多)指(趾)畸形,并多指(趾)诊断明确。基因克降及测序结果表明家系中所有患者都携带HOXD13第一外显子聚丙氮酸链编码区24bp不完全三核苷酸重复序列的杂合插入突变,使聚丙氮酸链额外延伸了8个丙氮酸残基,而在家系内正常成员和60例正常汉族人群中均未发现该突变。本研究中并多指(趾)家系患者表型差异大,呈常染色体显性遗传。HOXD13基因第一外显子内8个丙氨酸残基的延伸突变与该家系患者的表型共分离,是该家系的致病基因突变。第二部分利用外显子组测序鉴定一手足裂畸形家系的致病基因手足裂畸形(split-hand/split-foot malformation, SHFM)是一种严重影响患者精细活动的先天性肢端畸形,由肢端正中轴发育不全导致,典型临床表现为手足中央纵向裂隙,伴缺指(趾)、并指(趾)及端骨的发育不全,形似螯状,也称为缺指(趾)畸形。SHFM可以单独发生(非综合征型),也可合并其它系统异常(综合征型)。SHFM具有高度遗传异质性,目前已定位的致病基因位点包括：SHFM1(MIM183600), SHFM2(MIM313350)、SHFM3(MIM600095)、SHFM4(MIM605289)、 SHFM5(MIM606708)和SHFM6(MIM225300),分别位于染色体7q21、Xq26、10q24、3q28、2q31和12q13,其中SHFM1、SHFM4和SHFM6位点的致病基因已经明确,分别是DLX5基因、TP63基因和WNT1Ob基因。DLX5基因位于染色体7q21区域内,属于DLX同源盒基因家族,编码转录因子家族成员,主要在胚胎早期发育中表达,调控脊椎动物肢端发育和形态发生。据文献报道,DLX5基因具有类癌基因功能,在肺癌和淋巴瘤组织中高表达,可与MYC基因内两个不同的启动子位点结合,转录激活MYC基因表达从而促进细胞增殖。我们在山东临沂地区采集了一个SHFM家系,对家系患者进行详细的临床和影像学检查,明确诊断为非综合征型SHFM。首先选取候选基因TP63进行突变检测,结果未见异常。然后对家系先证者进行外显子组测序,测序结果经过人类基因组参考序列比对、数据库筛查后,结合已定位遗传位点内的候选基因,对可疑变异进行筛查发现,SHFM1位点DLX5基因第3外显子内存在一杂合错义突变。然后,通过直接测序,对家系患者及正常成员该突变位点进行检测,发现该突变与疾病表型共分离；随后在200名健康人群中进行验证,也未发现该突变,说明该位点不是罕见多态,而是SIIFM1致病突变。最后,利用人类DLX5基因野生型、突变型表达载体和MYC基因启动子荧光素酶表达载体进行细胞转染,通过检测荧光素酶表达活性分析突变基因对MYC基因的转录激活作用,结果发现DLX5突变基因调控MYC基因表达的功能显著下降,进一步证实该突变的致病性。本研究中SHFM家系三代8位成员中,共有患者2例(女1例,男1例),符合常染色体显性遗传,外显率完全。家系患者表现度差异不大,双足均呈一致的典型正中裂畸形,双手拇指发育基本正常,伴或不伴三节拇指畸形。DLX5基因c.5586>T杂合突变为该家系致病突变,先证者是家系中首发突变者。群体验证和荧光素酶表达活性检测结果表明,该突变不是良性多态位点,而是SHFM1的致病突变。本研究首次发现DLX5基因突变导致常染色体显性遗传性非综合征型SHFM的发生,为进一步研究疾病的发生机制奠定基础。