论文部分内容阅读
目的: 研究蓝莓花青素对口腔癌KB细胞裸鼠异位移植瘤生长的抑制作用以及在自噬与凋亡方面的影响,探讨自噬与凋亡在蓝莓花青素抑制口腔癌KB细胞裸鼠异位移植瘤生长中的分子作用机制以及自噬与凋亡之间的关系,从而为花青素的抗癌研究提供相应依据。 方法: 构建裸鼠口腔癌模型:在裸鼠腋窝中下部皮下注射KB细胞悬液,10天左右待瘤体达到5×5mm3,随机分为8组,每组4只。阴性对照组(腹腔注射生理盐水,10mg·kg-1)、阳性对照组(腹腔注射顺铂,4mg·kg-1)、三个蓝莓花青素处理组(腹腔注射低、中、高剂量蓝莓花青素,25mg·kg-1,50mg·kg-1,100mg·kg-1)和三个干预组(腹腔注射体内自噬抑制剂氯喹(CQ)50mg·kg-1+低、中、高剂量蓝莓花青素,25mg·kg-1,50mg·kg-1,100mg·kg-1)。各组进行相应药物处理,每三天注射一次,处理4周;期间观察裸鼠体重和瘤体生长变化,绘制裸鼠体重变化曲线以及瘤体生长曲线;药物处理结束后,剥离瘤体,液氮保存及4%的多聚甲醛固定。自噬分析:(1)在透射电子显微镜下观察自噬小体的超微结构。(2)qPCR法检测自噬相关基因LC3、Beclin1、ATG5的mRNA的表达水平。(3)Western Blot法检测自噬相关蛋白LC3,Beclin1的表达水平。凋亡分析:(1)Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-8、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9的表达水平。(2)免疫组化法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-8的表达。自噬与凋亡关系分析:应用自噬抑制剂CQ抑制自噬,Western Blot检测自噬相关蛋白LC3,Beclin1和凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Cleaved-caspase3,Cleaved-caspase9的表达水平。 结果: 裸鼠称重结果显示,与阴性对照组相比,蓝莓花青素处理组和干预组的裸鼠体重变化差异不显著;瘤体重量测量结果显示,与阴性对照组相比,蓝莓花青素处理组以及加入自噬抑制剂CQ的干预组明显抑制了瘤体的生长,但处理组与干预组组间差异均不显著,低中高剂量实验组及干预组的抑瘤率分别为47.2%、46.2%、50.9%、48.4%、52.3%、45.3%。蓝莓花青素诱导口腔癌KB细胞自噬:透射电镜结果显示,与阴性对照组相比,蓝莓花青素处理组中出现明显的自噬小体超微结构,且随给药浓度的增大自噬小体增多;qPCR实验结果显示蓝莓花青素处理组LC3、Beclin1、ATG5mRNA表达水平均高于阴性对照组且呈剂量依赖性增高,具有显著差异;Western Blot结果与qPCR结果一致,与阴性对照组相比,蓝莓花青素处理组自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达均增加,且呈一定的剂量依赖性。蓝莓花青素诱导口腔癌KB细胞凋亡:Western Blot结果显示,与阴性对照组相比,蓝莓花青素处理组凋亡相关蛋白caspase-8、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9和Bax上调,且呈一定的剂量依赖性,Bcl-2蛋白表达水平较阴性对照组极其显著下调,且呈剂量依赖性下降;免疫组化结果与Western Blot结果一致,蓝莓花青素处理组的caspase-8和Bcl-2表达分别高于和低于阴性对照组。与蓝莓花青素处理组相比较,干预组自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达水平下降;凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9和Bax的表达水平均高于蓝莓花青素处理组。 结论: 蓝莓花青素能够通过诱导自噬与凋亡抑制口腔癌KB细胞裸鼠异位移植瘤的生长,并且抑制蓝莓花青素诱导的KB细胞自噬可能促进蓝莓花青素诱导的内源性凋亡。