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目的:鉴定照射细胞中及外泌体内miRNAs的差异表达谱,获取辐射诱导表达的mi RNAs在细胞中和外泌体内的信息及其时间效应,研究辐射旁效应(RIBE)在人脐静脉血管内皮细胞HUVEC细胞中的生物学效应及相关机制。方法:利用超高速离心法收集对照组以及4Gy剂量照射细胞分泌的外泌体,运用透射电镜及Western Blotting技术对所收集外泌体进行形态、大小和标志蛋白的鉴定,使用miRNA芯片技术分析细胞内和外泌体中的mi RNAs表达谱,Real-Time PCR方法验证部分差异miRNAs,通过mi RDB和TargetScan预测差异mi RNAs的靶基因,DAVID、KEGG等在线工具进行生物信息学分析,PPI网络图结合Cytoscape筛选中心节点基因,调研文献进行预测分析。用0.22μm滤器过滤照射后0.5h的细胞培养上清作为条件培养基,观察其对人脐静脉血管内皮细胞HUVEC产生的辐射旁效应及相关机制,包括:采用CCK8法检测细胞增殖,通过流式细胞计术检测细胞凋亡和细胞周期,利用微核计数法和观察53BP1 foci的形成率来分析DNA损伤情况,采用Western Blotting技术检测周期相关蛋白CHK1-pS345、CHK2-pT68等的表达变化,通过流式法检测细胞内ROS变化水平,利用激光共聚焦显微镜观察外泌体在旁细胞中的摄入。结果:(1)人脐静脉血管内皮细胞HUVEC细胞经4Gy照射后miRNAs表达谱发生显著改变,来自受照细胞的外泌体miRNAs与对照细胞外泌体miRNA相比,照射后0.5h共鉴定到18个发生表达变化的miRNAs,其中5个表达上调,13个表达下调;照射后2h鉴定出16个表达上调、5个表达下调miRNAs;受照射细胞中miRNAs与对照组相比,照射后0.5h和照射后2h分别有38个和85个差异表达miRNAs,且差异有统计学意义(P<0.01);且在照射后0.5h和2h的HUVEC来源的外泌体中,miR-6729-5p均表达上调;(2)对筛选到的辐射诱导相关差异mi RNAs进行RT-qPCR验证,确定HUVEC细胞内照射后0.5h miR-4267、miR-5096、mi R-1307-3p、miR-1260b、miR-6729-5p、mi R-4638-5p、let-7e-5p等7个miRNA表达显著上调(P<0.05),差异有统计学意义;在HUVEC细胞内照射后2h mi R-29b-3p、miR-5096、mi R-615-5p、miR-1307-3p、miR-1260b、miR-6729-5p等6个miRNA表达上调(P<0.05),差异有统计学意义;(3)经KEGG分析发现,照射后0.5h细胞内上调差异miRNAs所调控的靶基因功能信号通路主要富集在MAPK通路、内吞作用、Rap1通路、Ras通路、Hippo通路等,而下调差异miRNAs所调控的靶基因功能信号通路主要富集在轴突向导,cAMP通路等;(4)利用PPI网络图筛选中心节点基因,发现mi R-6729-5p可能通过靶向调节YWHAZ基因,miR-5096可能通过靶向调节BRCA1、HDAC1、TGFBR1、PIK3R1、UBQLN1等基因,miR-1260b可能通过靶向调节YWHAZ、SMAD2、PTPN11等基因,从而参与调控细胞放射损伤反应或辐射旁效应;(5)4Gy照射人脐静脉血管内皮细胞HUVEC细胞后0.5h收集的条件培养基能导致未受照细胞增殖减弱(P<0.05),凋亡增加(P<0.01),微核数目明显增加(P<0.01),ROS水平增高,DNA损伤相关蛋白53BP1的foci形成增多;(6)辐射旁效应(RIBE)导致未受照细胞发生G2/M周期阻滞;Western Blotting分别检测CHK1-pS345、CHK2-pT68以及其他周期阻滞标志蛋白,与流式结果一致。结论:1.电离辐射损伤导致HUVEC细胞内和外泌体中的miRNAs表达谱发生显著改变,且有明显的时间依赖性;2.经RT-qPCR验证,证实mi RNA芯片检测数据可信;使用生物信息学分析,结果表明miR-6729-5p可能通过靶向调节YWHAZ基因,mi R-5096可能通过靶向调节HDAC1、TGFBR1、PIK3R1、BRCA1、UBQLN1等基因,miR-1260b可能通过靶向调节SMAD2、PTPN11、YWHAZ、UBQLN4等基因,在细胞放射损伤反应的信号通路调节中发挥重要;3.辐射旁效应导致未受照细胞增殖减弱、凋亡增加、ROS水平增高,微核数目明显增加、DNA损伤相关蛋白53BP1的foci形成增多等一系列生物学反应;4.辐射旁效应导致未受照细胞发生G2/M周期阻滞,导致CHK1-pS345、CHK2-pT68以及其他周期阻滞标志蛋白的激活。