珍珠作为一种有机宝石广泛用于饰品、化妆品等领域,而其仿生学材料的研发也是当前的研究热点。珍珠质量的决定因素包括颜色、大小、形状、光泽、光洁度、有核珍珠珠层厚度等6个方面,其中,颜色是决定珍珠质量的重要因素,不同颜色的珍珠价格相差较大。同时,根据几丁质在珍珠质有机基质中所起的关键作用,以及几丁质合成酶抑制后的贝壳形成情况,可以推测几丁质与珍珠的大小、形状、光泽等相关。与颜色决定、几丁质形成等珍珠质量有关的分子机制仍不完全清楚,但均与珍珠形成过程密切相关。本研究利用三角帆蚌紫色和白色贝壳珍珠质颜色品系,应用罗氏454测序技术,开展转录组学研究,筛选与珍珠形成有关,特别是与珍珠质量有关的基因,筛查与珍珠质不同颜色有关的差异表达基因,研究几丁质合成途径的重要基因,丰富对淡水珍珠质量形成机制的认识。1.三角帆蚌外套膜c DNA文库的构建和珍珠形成相关基因分析采用罗氏454测序技术从分泌紫色和白色珍珠质的三角帆蚌外套膜中获得了981,302个高质量EST序列。从分泌紫色珍珠质的三角帆蚌外套膜c DNA文库中获得了541,268条序列,平均长度为298 bp;从分泌白色珍珠质的三角帆蚌外套膜c DNA文库中获得了440,034条序列,平均长度为293 bp。这些EST序列聚类和组装成222,158个具有开放阅读框的单一序列。采用GO基因注释、KEGG分析、COG分析等方法,对这些序列的功能进行了预测。通过分析,发现其中33个基因可能参与生物矿化过程,包括6个参与几丁质合成和修饰的基因,5个酸性贝壳基质蛋白基因,2个碱性贝壳基质蛋白基因,10个钙代谢基因,6个金属离子代谢基因,2个细胞基质蛋白基因和2个细胞基质结合蛋白基因。6个与几丁质相关的基因分别为几丁质合成酶、几丁质链接围食膜因子-A、几丁质乙酰转移酶5、几丁质乙酰转移酶1、几丁质酶和几丁质3蛋白。据报道,紫色珍珠和白色珍珠相比,含有较高的Zn、Mg、Ti、V、Ag、Co等离子。本研究中还发现有6个和金属代谢有关的基因,分别为多铜氧化酶、镁钴离子转运子、铁蛋白、镉金属硫蛋白、基质金属蛋白、虾红素样蛋白。这些基因序列与分子标记的发掘,为具体研究参与珍珠形成以及质量相关的功能基因,通过分子标记指导品种选育奠定了基础。2.与珍珠质颜色有关的基因表达差异分析以及SSR、SNP筛选利用获得的转录组序列信息,对分泌紫色和白色珍珠的三角帆蚌外套膜进行数字基因表达谱比较分析,尝试在m RNA表达水平上寻找参与决定珍珠颜色的基因。研究结果表明,在发掘的358个差异表达基因中,有137个基因在紫色系文库中高表达,221个基因在白色系文库中高表达(错误率<0.001),发现了一批具有特定功能的差异表达基因。在差异表达基因中,有22个已经功能注释的基因在紫色系中高表达,20个已经功能注释的基因在白色系中高表达。发现与维生素B12(钴胺素)吸收相关的胃内因子在紫色系文库中高表达,同时在三角帆蚌转录组分析也注释到一个镁钴离子转运子基因,其中维生素B12是否与珍珠颜色有关非常值得进一步研究。同时,表达谱比较分析也发现两种组织的贝壳基质蛋白分泌存在差异,在紫色系文库中发现有较多参与调控晶体多型的基因呈现高表达水平,而在白色系文库中,发现较多参与调控晶体生成的基因呈现高表达水平。这些获得功能注释的差异表达基因参与信号传导,细胞增殖、分化和凋亡,细胞-细胞和细胞-基质相互作用等。此外,从这些EST序列中鉴定到9,474个可能的SSR标记,27,303个SNP位点标记,其中包含13,087个转换位点,9,944个颠换位点与4,272个插入和缺失位点。本研究为研究珍珠质颜色形成的机制、珍珠或壳的形成和壳演化提供了宝贵的参考资料。本研究发掘的分子标记将为遗传连锁分析和数量性状位点(QTL)分析提供了基础。3.三角帆蚌几丁质合成途径7个基因序列分析、同源比较及组织分布在昆虫中发现几丁质合成途径上共有8个不同的酶,在三角帆蚌转录组分析中,仅注释到几丁质合成酶,结合在昆虫上已经发现的合成途径其它酶序列,进一步对转录组测序结果进行BLAST分析,发现了类海藻糖酶、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、谷氨酸盐:果糖-6-磷酸转氨酶、葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶、磷酸乙酰氨基葡萄糖变位酶及UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶等其他7个合成途径酶的c DNA序列片段。通过序列分析、序列同源比较、进化分析、蛋白结构模拟、时空表达分析等研究发现,上述各基因的核酸片段及翻译的氨基酸序列、基因功能与数据库中其它物种7个酶相比,具有很高的相似性。由此可见,三角帆蚌体内可能存在类似于昆虫的几丁质合成途径,在该途径也有上述7个酶的参与。组织分布表明,三角帆蚌海藻糖酶基因主要分布于外套膜内,外套膜是贝壳与珍珠形成的主要组织,表明该基因可能类似于昆虫的可溶性海藻糖酶基因。此外,综合分析上述7个基因的组织分布,结果显示除了海藻糖酶基因和UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶基因组织分布呈现特定组织的显著表达,其它基因均为组成性表达。这可能与上述组织参与其它生物合成代谢过程有关,表明这些基因可能不但参与几丁质的合成,也涉及参与其它物质合成与代谢过程。4.三角帆蚌几丁质合酶基因Hc CHS1序列分析及表达模式研究将转录组测序获得的几丁质合成酶基因核酸片段和5′端RACE所获得核酸片段进行拼接整理,获得一个长度为6,906 bp的核酸序列,编码2300个氨基酸。对其编码蛋白进行结构预测的结果显示,该蛋白含有1个肌球蛋白My Sc结构域、1个几丁质合成酶结构域和12个跨膜结构域。Blast P在线比对分析显示,经翻译所获得的氨基酸序列与合浦珠母贝和硬笔贝几丁质合成酶1(CHS1)氨基酸序列同源性最高,均为67%。进化树分析显示,三角帆蚌几丁质合成酶基因与海洋贝类如紫贻贝、太平洋牡蛎、合浦珠母贝及硬笔贝进化关系较近。三维结构模拟结果显示,与其他物种的几丁质合成酶相比,该蛋白具有类似的分子构象,虽然跨膜结构域的数量只有12个,与之前报道的硬笔贝相比少了4个,也比昆虫平均16-18个跨膜结构域的数量少,但该蛋白分子的基本构象没有改变,特别是催化中心的结构没有改变,预示了该分子的基本功能没有改变,仍然能执行几丁质合成酶的功能。同源比较发现,三角帆蚌几丁质合成酶氨基酸序列与紫贻贝CHS1和硬笔贝CHS1的同源性最高。此外,表达模式分析显示,该基因主要表达于外套膜,其它组织含量相对较低;并且在破壳诱导12 h后,该基因在外套膜呈现上调表达,破壳24 h后仍保持较高表达量,约为正常值的2倍,这表明该基因可能参与三角帆蚌贝壳的再生。鉴于外套膜类似于昆虫的表皮,其在贝类贝壳及珍珠形成过程中起主要作用,本研究认为该几丁质合成酶与昆虫合成表皮几丁质的合成酶类似,属于A类几丁质合成酶(CHSA或CHS1),可能参与三角帆蚌贝壳及珍珠的形成过程。综上所述,本论文通过三角帆蚌转录组测序,获取了一批与珍珠形成相关的基因序列,筛选了一批SSR与SNP标记;针对珍珠质量相关决定因素,比较了分泌紫色和白色珍珠质的外套膜转录组差异,获得了大量表达差异基因;发现并鉴定了几丁质合成途径的关键酶基因及存在形式,确定三角帆蚌CHS1可能参与调控三角帆蚌贝壳与珍珠的形成。以上工作的开展,对于探索珍珠质量相关的关键因素,了解淡水珍珠形成的机制,指导优良育珠品种的培育,均具有重要作用。