研究背景及目的：动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是感染、炎症、自身免疫等多种因素参与作用的病理过程。研究表明AS斑块破裂和继发血栓形成是急性心肌梗死、脑卒中、猝死等一系列急性心脑血管事件主要原因,这一病理过程的发生与否取决于AS斑块稳定性。易损斑块(Vulnerable Plaque)是指AS斑块中易于进展为罪犯病变或者易于形成血栓的斑块,它具有纤维帽变薄,脂质核心增大,平滑肌细胞、胶原含量减少,炎性细胞丰富等特点。随着心脑血管事件的日益增多,易损斑块相关研究已成为全球范围内AS研究中的热点。钠尿肽C型受体(Natriuretic Peptide C Receptor, NPR-C)最初被认为是-种无任何生理功能的钠尿肽清除受体,钠尿肽家族通过与NPR-C结合后内化、降解达到从血液循环中被清除的目的。随着研究的深入,一系列的证据表明钠尿肽C型受体还对心血管系统及多种器官具有广泛作用。目前研究认为C型钠尿肽(C-type Natriuretic Peptide, CNP)具有抗动脉粥样硬化的作用,这与其调节平滑肌细胞的增殖、抑制白细胞募集、抗血小板聚集、调节阻力血管张力等作用密不可分,且大量研究证据表明CNP的这些心血管系统保护功能主要通过CNP/NPR-C信号通路起作用。而且既往文献报道NPR-C在PCI术后1-9个月新生内膜平滑肌细胞中强烈表达,提示其参与调节人类PCI术后新生内膜生长。些学者还发现NPR-C特异性激动剂一-C-ANP4-23及NPR-C胞内不同区域的小型肽类部分能够调节A10血管平滑肌细胞中血管活性肽引起的蛋白合成,从而抑制血管肥厚反应。本课题组在前期实验研究中采用NPR-C基因过表达和沉默技术,证实了NPR-C基因可改善ApoE-/-小鼠主动脉根部AS病变进程,然而NPR-C基因对于AS斑块稳定性的作用尚不清楚。基于此,我们提出如下假说：NPR-C基因能够稳定AS斑块。为解决上述问题,我们构建了ApoE-/-小鼠颈动脉易损粥样斑块模型及过表达NPR-C的慢病毒,并成功将慢病毒局部转染ApoE-/-小鼠颈动脉,同时设立生理盐水(normal saline, NS)对照组和LV-EGFP空载体组,应用病理组织学及分子生物学技术检测相关指标,以此阐明NPR-C在ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块稳定性中的作用。研究方法1. ApoE-/-小鼠颈动脉易损粥样斑块模型构建70只8周龄的雄性ApoE-/-小鼠,SPF级,遗传学背景为C57BL/6,购自于北京华阜康生物科技股份有限公司,饲养于山东大学齐鲁医院心血管重构与功能研究实验室动物实验中心。给予小鼠充足的水源和食物,保持室内恒温恒湿,12h光照和12h黑暗交替。小鼠适应性高脂喂养2周后,给予腹腔麻醉后行右侧颈总动脉套管术。沿着小鼠颈部正中切开皮肤,暴露右侧颈总动脉,将内径0.30mm,长度2.5mm颈动脉硅胶套管置于右侧颈总动脉血管近分又处外周,细线固定套管,仔细缝合皮肤。于小鼠股部肌肉注射青霉素钠预防感染,继续高脂喂养5周。2.过表达NPR-C的慢病毒局部转染小鼠颈动脉小鼠行右侧颈总动脉套管术并高脂喂养5周后,施行局部慢病毒转染。将70只小鼠随机分成3组：NS组(n=20)、LV-EGFP组(n=20)和LV-NPR-C组(n=30)。小鼠麻醉后,沿颈部正中切开皮肤,分离出右侧颈总动脉,暴露血管外膜,将100uL慢病毒稀释液(2×10^7 TU)或者100uLNS通过血管外膜局部浸润到右侧颈总动脉内,继续高脂喂养4周后行安乐死。其中,病毒转染小鼠两周后从LV-EGFP组随机抽取两只小鼠,行安乐死后用OCT包埋右侧颈动脉,制作冰冻切片,并在荧光显微镜下观察颈动脉斑块内荧光情况。3.体重及血生化指标检测分别在局部转染病毒前及小鼠处死前采取血液标本,测量体重(body weight)、血糖(Glucose)、甘油三酯(Total Cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol, HDL-C)、总胆固醇水平(Triglyceride, TG)。4.血压及心率指标检测分别在局部转染病毒前及小鼠处死前使用智能无创血压计测量小鼠收缩压(Systolic Blood Pressure, SBP),舒张压(Diastolic Blood Pressure, DBP),平均动脉压(Mean Blood Pressure, MBP)及心率(Heart Rate, HR)。小鼠血压每日固定时间段测量,连续测量3天,每天测量3次,取平均值。5.组织病理学染色小鼠行安乐死后,将右侧颈动脉包埋后制作石蜡或者冰冻病理切片。颈动脉切片采用HE染色观察各组颈动脉斑块的大小及形态；采用天狼猩红染色观察各组颈动脉斑块内Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量。颈动脉冰冻切片采用油红O染色观察各组颈动脉斑块内脂质的含量。6.免疫组织化学染色小鼠颈动脉切片采用免疫组织化学染色方法检测各组颈动脉斑块内平滑肌抗原(α-Smooth Muscle Actin, α-SMA)、NPR-C、心房钠尿肽(Atrial Natriuretic Peptide, ANP)、CNP抗原的含量。小鼠颈动脉冰冻切片采用免疫组织化学染色方法检测各组颈动脉斑块内巨噬细胞(Macrophage, MAC)抗原的含量。根据公式计算斑块易损指数：斑块易损指数=(巨噬细胞含量百分比+脂质含量百分比)／(平滑肌细胞含量百分比+胶原含量百分比1。7. RT-PCR反应Trizol法提取小鼠右侧颈动脉组织中RNA,定量后将其逆转为cDNA,再利用荧光定量PCR法扩增cDNA以此检测小鼠颈动脉组织中NPR-C、基质金属蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9, MMP-9)、血管细胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) mRNA表达水平。以小鼠β-actin作为内参。实验结果采用2-ΔΔCt方法统计分析。各项实验指标重复3次以上。8. Western blot检测提取小鼠右侧颈动脉组织中总蛋白,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各蛋白质组分后,采用湿转法将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜上,随后5%脱脂牛奶封闭、TBST清洗、孵育相应一抗过夜。次日抗原和抗体复合物孵育二抗,最后利用辣根过氧化物酶标记的底物进行化学发光显色。使用Image J图像分析软件以β-actin作为内参,定量检测小鼠颈动脉组织中NPR-C、ANP、CNP、肿瘤坏死因子-α (Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MonocyteChemotactic Protein-1, MCP-1)的蛋白表达水平。统计分析计数资料均以均数±标准差表示,应用SPSS18.0软件包进行统计学分析,两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析AVON A,以P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1. ApoE-/-小鼠一般情况70只8周龄的雄性ApoE-/-小鼠,行右侧颈总动脉套管术并给予局部孵育慢病毒或NS,共计高脂饮食1 1周,小鼠整个实验过程未见感染及意外死亡。2.慢病毒局部成功转染小鼠颈动脉局部转染病毒2周后,LV-EGFP组随机选取的两只小鼠,荧光显微镜下颈动脉冰冻切片见斑块处有明显绿色荧光表达。免疫组织化学染色显示：与NS组和LV-EGFP组相比较,LV-NPR-C组颈动脉斑块内NPR-C含量明显增加(P<0.05)；NS组和LV-EGFP组相比较,颈动脉斑块内NPR-C含量差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot显示：与NS组和LV-EGFP组相比较,LV-NPR-C组颈动脉组织中NPR-C表达量明显增加(P<0.05)；NS组和LV-EGFP组相比较,颈动脉组织中NPR-C表达量无统计学差异(P>0.05)。PCR结果显示：与NS组和LV-EGFP组相比较,LV-NPR-C组颈动脉组织中NPR-C mRNA含量明显增加(P<0.05);NS组和LV-EGFP组相比较,颈动脉组织中NPR-C mRNA含量无统计学差异(P>0.05)。结果表明慢病毒局部转染小鼠颈动脉成功。3. NPR-C基因过表达组小鼠体重及血生化指标比较NS组、LV-EGFP组、LV-NPR-C组三组小鼠在病毒转染前后体重及血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇水平,未见明显统计学差异(P>0.05)。4. NPR-C基因过表达组小鼠心率及血压水平比较NS组、LV-EGFP组、LV-NPR-C组三组小鼠在病毒转染前后心率(Heart Rate,HR)、收缩压(Systolic Blood Pressure, SBP)、舒张压(Diastolic Blood Pressure,DBP)、平均动脉压(Mean Blood Pressure, MBP)的变化,未见明显统计学差异(P>0.05)。5. NPR-C基因过表达组颈动脉斑块内脂质含量显著减少颈动脉斑块冰冻切片油红0染色显示：与NS组和LV-EGFP组相比较,LV-NPR-C组颈动脉斑块内脂质含量明显降低(P<0.05)；NS组和LV-EGFP组相比较,两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。6. NPR-C基因过表达组颈动脉斑块内巨噬细胞含量显著减少颈动脉斑块冰冻切片免疫组织化学染色显示：与NS组和LV-EGFP组相比较,LV-NPR-C组能明显降低颈动脉斑块内巨噬细胞含量(P<0.05)；NS组和LV-EGFP组相比较,两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。7. NPR-C基因过表达组颈动脉斑块内平滑肌抗原含量显著减少颈动脉斑块切片免疫组织化学染色显示：与NS组和LV-EGFP组两对照组相比较,LV-NPR-C实验组颈动脉斑块内平滑肌抗原含量明显降低(P<0.05)；NS组和LV-EGFP组相比较,两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。8. NPR-C基因过表达组颈动脉斑块内胶原含量显著增加颈动脉斑块切片天狼猩红染色显示：与NS组和LV-EGFP组相比较,LV-NPR-C组能明显增加颈动脉斑块内Ⅰ、ⅢI型胶原含量(P<0.05)；NS组和LV-EGFP组相比较,两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。9. NPR-C基因过表达组颈动脉斑块易损指数显著降低根据斑块易损指数公式计算,与NS组和LV-EGFP组相比较,LV-NPR-C组颈动脉斑块易损指数明显下降(P<0.05)；NS组和LV-EGFP组相比较,两组颈动脉斑块易损指数差异无统计学意义(P>0.05)。10. NPR-C基因过表达显著减少ANP、CNP配体表达颈动脉斑块切片免疫组织化学染色显示：与NS组和LV-EGFP组相比较,LV-NPR-C组能明显降低颈动脉斑块内ANP配体(P<0.05)和CNP配体(P<0.05)的含量；NS组和LV-EGFP组相比较,颈动脉斑块内ANP配体(P>0.05)和CNP配体(P>0.05)的含量差异无统计学意义。Western blot显示：与NS组和LV-EGFP组相比较,LV-NPR-C组能明显降低颈动脉组织中ANP配体(P<0.05)和CNP配体(P<0.05)表达量；NS组和LV-EGFP组相比较,颈动脉组织中ANP配体(P>0.05)和CNP配体(P>0.05)的含量差异无统计学意义。11. NPR-C基因过表达显著减少炎症因子TNF-α、MCP-1、MMP-9、VCAM-1的表达Western Blot显示：与NS组和LV-EGFP组相比较,LV-NPR-C组能明显降低颈动脉组织中TNF-α(P<0.05)、MCP-1 (P<0.05)的蛋白含量；NS组和LV-EGFP组相比较,颈动脉组织中TNF-α (P>0.05)、MCP-1 (P>0.05)的蛋白含量差异无统计学意义。PCR结果显示：与NS组和LV-EGFP组相比较,LV-NPR-C组颈动脉组织中MMP-9 mRNA和VCAM-1 mRNA表达明显降低(P<0.05)；NS组和LV-EGFP组相比较,颈动脉组织中MMP-9 mRNA和VCAM-1 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论构建小鼠颈动脉易损粥样斑块模型,局部转染过表达NPR-C的慢病毒,证实了NPR-C能够改善斑块的组成成分,抑制炎性因子的表达,增加斑块稳定性。