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盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse, POP)是一种严重影响中老年妇女健康和生活质量的疾病,尽管POP的发病率较高,但是其发病机制尚不十分清楚。目前的很多研究显示盆底结缔组织的异常能引起POP,而弹性纤维的缺失是结缔组织老化的基础。生理条件下,Fibulin-4以单体形式存在于细胞外基质,通过与赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)前肽、LOX、弹性蛋白原的相互作用,有效地指导弹性蛋白的交联,促进弹性纤维的完全成熟。原纤维蛋白-1(Fibril1in-1)组成的微纤维为弹性蛋白原的交联提供支架,而且通过与弹性蛋白原之间的绑定,来促进弹性蛋白原侧链规范排列,从而使弹性蛋白原的交联更加有效率。本研究旨在通过检测Fibulin-4蛋白与Fibrillin-1蛋白在POP组与对照组表达情况的变化,初步探讨二者与POP的可能关系,为盆腔器官脱垂发病的分子生物学研究提供一定的理论依据。
实验方法:
一、材料
POP组17例患者的主韧带、膨出阴道前壁组织与9例对照组患者主韧带、膨出阴道前壁组织均来自2009年2月到2009年10月间中国医科大学附属盛京医院妇科手术切除的组织。所有组织均经福尔马林固定,常规石蜡包埋。
二、主要试剂
Fibulin-4兔抗人多克隆抗体及原纤维蛋白-1鼠抗人单克隆抗体购自Abcam公司,二氨基联苯胺(DAB)显色剂及即用型SABC免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
三、方法
免疫组化方法
按链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术行免疫组织化学染色。切片常规脱蜡至水,灭活内源性酶,酶(胃蛋白酶、EDTA)消化法进行抗原修复,血清封闭,一抗4℃冰箱过夜、滴加二抗、滴加SABC、DAB显色,苏木素染色、脱水、封片。结果判定:光镜下在每张切片中随机选取5个高倍视野经数码显微摄像后输入计算机,用Image Pro Plus6.0软件测量免疫组织化学染色阳性区域的累积光密度和切片组织总面积,计算切片组织平均光密度。
四、统计学分析
对所得各组数据以均值±标准差(-X±SD)表示,运用SPSS13.0统计软件对所得数据进行非参数Mann-Whitney检验,检验水准P<0.05定为结果有显著性差异,表示有统计学意义。
实验结果:
一、Fibulin-4蛋白表达情况
Fibulin-4蛋白主要表达于细胞外基质,免疫组化染色后呈黄色或棕黄色,在POP组患者子宫主韧带及阴道前壁组织中Fibulin-4蛋白表达的平均光密度分别为0.0108±0.0087、0.0082±0.0051,对照组平均光密度分别为0.0214±0.0149、0.0155±0.0080,二者比较有显著性差异(P=0.022、0.019)。在POP组中,Fibulin-4蛋白的表达与脱垂程度、患者是否伴有压力性尿失禁、患者绝经状态及阴式分娩次数均不相关(P>0.05),见表2。
二、Fibrillin-1蛋白表达情况
Fibrillin-1蛋白主要定位于细胞外基质,免疫组化染色后呈黄色或棕黄色。在POP组患者阴道前壁组织中Fibrillin-1蛋白表达的平均光密度为0.0189±0.0099,对照组平均光密度为0.0111±0.0064,二者比较有显著性差异(P=0.029);在POP组患者子宫主韧带组织中Fibrillin-1蛋白表达的平均光密度为0.0150±0.0086,对照组平均光密度为0.0134±0.0058,二者比较有无显著性差异(P=0.850)。在POP组中,Fibrillin-1蛋白的表达与脱垂程度、患者是否伴有压力性尿失禁、患者绝经状态及阴式分娩次数均不相关(P>0.05),见表2。
三、POP组主韧带、阴道前壁中Fibulin-4和Fibrillin-1蛋白表达的相关性
对POP组进行Spearman相关性分析,Fibulin-4与Fibrillin-1蛋白在主韧带中的表达无相关性(rs=0.465,P=0.060);Fibulin-4与Fibrillin-1蛋白在阴道前壁中的表达无相关性(rs=0.130,P=0.619)。
结论:
Fibulin-4蛋白Fibulin-4蛋白在POP患者子宫主韧带和阴道前壁组织表达下降,可能与POP的发生有关。