论文部分内容阅读
目的：本研究拟通过基因工程技术表达五株我国轮状病毒（Rotavirus，RV）流行株P[4]、P[6]和P[8]型RV的VP8*蛋白，并制备其多克隆抗体，通过酶免疫分析试验（Enzyme immune assays，EIA）为基础的唾液结合实验和寡糖结合实验分析我国主要基因型P[4]、P[6]和P[8]型毒株与组织血型抗原（Histo-blood group antigens，HBGAs）的相关性，以获得我国RV流行株与HBGAs的结合模式，从而确定轮状病毒流行株感染的宿主范围，为进一步研究RV与宿主受体之间的关系及RV疫苗和防治药物的研发提供实验基础和理论依据。 方法：选择P[4]型RV代表株11151099和11151328、P[6]型代表株5311142及P[8]型代表株11221075和11221345，根据已有引物对RV的VP8*区进行扩增，通过基因工程技术构建重组质粒pGEM-T Easy-VP8*和表达质粒pGEX-4T1-VP8*，利用GST原核表达系统经过IPTG诱导、超声破碎细胞及SDS-PAGE鉴定后证实在上清中获得GST-VP8*融合蛋白，利用琼脂糖-4B柱对融合蛋白进行纯化并通过凝血酶去除GST标签以获得VP8*蛋白。将纯化的11151099、5311142和11221075的VP8*蛋白分别免疫2只20周龄的雌性SPF级新西兰白兔，每只兔子免疫蛋白量约为100μg，首次加弗氏完全佐剂乳化，第二次开始采用弗氏不完全佐剂，注射体积为400μL，背部皮内多点注射，共免疫6次，ELISA检测抗体效价。效价合格后进行全采血从耳部及心脏采取120-160mL血液，4℃过液离心获得血清，4℃保存备用。通过EIA唾液结合实验分析3个型别的轮状病毒流行株与唾液中的HBGAs受体的结合情况。利用HBGAs表型已明确的159份唾液样本包被96孔酶标板，封闭后加入已制备成功的P[4]、P[6]和P[8]型VP8*蛋白，以兔抗RV VP8*蛋白为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，TMB显色，用酶标仪在450nm波长处测定OD值。通过5个毒株的VP8*蛋白对lea、leb、lex、ley、A、B、H1和H2型寡糖进行EIA为基础的寡糖结合实验。综合唾液结合实验和寡糖结合实验分析五个轮状病毒流行株与HBGAs受体的结合模式。 结果：成功构建了我国五株RV流行株的pGEX-4T1-VP8*表达质粒；制备了五株P[4]、P[6]和P[8]型RV VP8*蛋白，大小约为27kDa；成功获得了兔抗P[4]、P[6]和P[8]型RV VP8*血清，EIA检测获得的三个多克隆抗体的抗血清效价均达到1：62500，可以满足实验要求；首次通过游离VP8*蛋白的唾液结合实验分析得到P[4]、P[6]和P[8]型RV与唾液HBGAs的结合模式，P[4]和P[8]型RV与A型、B型、AB型、O型分泌型（O+）中的leb抗原阳性的唾液结合，与O型非分泌型（O-）唾液不结合；而P[6]型RV5311142与A型、B型、AB型、O+型、O-型唾液均不结合；通过寡糖结合实验发现P[4]和P[8]型RV可以与leb和H1型抗原结合，而P[6]型RV5311142与各型寡糖均不结合。 结论：HBGAs与P[4]、P[6]和P[8]型RV的结合呈现毒株特异性。由唾液及寡糖结合实验综合分析发现P[4]和P[8]型RV可以与leb和H1型抗原结合，与O-型抗原不结合；P[6]型RV5311142与ABO、Lewis和分泌型抗原均无显著结合。本研究通过五株P[4]、P[6]和P[8]型RV VP8*蛋白的成功表达及唾液、寡糖结合实验的分析，首次发现了我国RV流行株与人HBGAs的结合模式，有助于了解RV的宿主适应特性及病毒进化和流行规律，为进一步研究RV与宿主之间的关系及RV疫苗和防治药物的研发提供重要的理论依据和实验基础。